九日

此文转载于《病理学杂志诊断》
2006年8月第13卷第4期·

石蜡包埋肿瘤组织单细胞核悬液制备方法的改进
蒋会勇,赵　彤　(南方医科大学附属南方医院病理科, 广州　510515)

1 　材料与方法
111 　材料　淋巴瘤、乳腺癌、肺癌和大肠癌标本各20 例,取自南方医科大学南方医院病理科。主要试剂:蛋白酶K(德
国Merck 公司产品) 、分析纯二甲苯、乙醇。主要仪器:高速离心机(德国Heraeus 公司产品) 。
112 　方法　首先对石蜡包埋肿瘤组织进行常规切片,苏木精- 伊红染色,在显微镜下确定肿瘤细胞密集的部位;然后
20μm厚切片,对照苏木精- 伊红染色片,利用显微切割仪切除非肿瘤组织及坏死组织;将切片放入115 ml 的聚丙烯离心
管中,加入二甲苯1 ml ,轻微振荡10 min ×2 ,弃去二甲苯加入1 ml 乙醇轻微振荡10min ×2 ,80 %乙醇1ml ,70 %乙醇1ml 逐级脱水,每次10 min ;弃去乙醇,加入1 ml 去离子水,离心后形成疏松的组织沉淀物,尽量倒去或吸出水分(不要搅动组织块) ;加入1 ml 的蛋白酶K消化液(TE 中011 mg/ ml 的蛋白酶K和015 %SDS) ,37 ℃孵育轻微振荡过夜;将混合物充分振荡后以1 000 r/ min ,离心5 s ,使混合物中的块状组织快速沉淀,此时被消化下来的单个细胞核尚留于上清中,小心吸取上层液体,即得到细胞核的悬液。通过细胞计数板进行细胞核密度的测定,根据实验需要调整细胞核的密度。
2 　结果
利用本实验方法,80 例组织中有75 例(9318 %) 一次性提取细胞核成功;其余5 例因含肿瘤细胞少,纤维结缔组织多,提取效果不理想,经过进一步选择同一病例含肿瘤组织丰富的蜡块再进行实验,提取细胞核成功(100 %) 。提取出的细胞核经滴片,苏木精- 伊红染色观察,发现细胞质均已消化除去,细胞核悬液中杂质少,形态完整清晰(图1)
3 　讨论
以往从石蜡包埋组织中提取细胞核的方法,不仅增加细胞悬液被污染的机会,而且对微量的液体进行操作比较困难。本研究改进了这一做法,对消化后的混合物进行快速短暂的离心,使混合物中未被消化的组织块沉淀于管底,而消化好的细胞核还位于上层的悬液中,不仅简化了实验步骤,而且实验证实分离单细胞核效果较好。对于含有大量纤维结缔组织的肿瘤,因纤维组织对消化的耐受性较强,因而提取细胞核较为困难,因此在选择标本时应选择肿瘤组织丰富的蜡块比较容易成功。
在取细胞核的过程中可以通过细胞计数板来确定悬液中细胞的密度,根据实验的要求进行调整,我们体会,将细胞调整在1 ×104Pμl 时进行滴片,细胞排布较密,且重叠现象较少,适合于FISH检测及DNA 定量分析。利用石蜡包埋组织提取细胞核进行实验,还可以在同一张载玻片上滴加多例组织的细胞进行实验,甚至还可制成细胞核的微阵列,大大节省了实验成本及实验时间,具有实际应用价值。