阿曼达245

一次我在组化抗原修复后没有用蒸馏水冲洗而是直接用PBS洗涤三次，结果全阴性只有未做过修复的抗体阳性了，查资料说是修复液与PBS 会发生交叉反应得到阴性结果，没有更详细的解释。哪位大侠能帮忙详细解释一下发生了怎样的交叉反应，最后又怎样导致只能得到阴性结果的，谢谢！

willfirm

以前我都是修复完了，自然冷却，然后直接放到PBS中浸泡。。。没有出现过这种现象。。
首先你要排除，修复的方式是否恰当有效。然后排除，修复之后是否出现过干片（干片是造成假阴性的重要原因）。
你可以试一下，连切的两组片子，一组修复后直接用PBS洗，一组先用蒸馏水洗。其他条件均相同。。。。看看结果。

资料上说的PBS与修复液是不是在修复之前的步骤？比如从PBS移到修复液中，切片上残留的PBS与修复液发生反应？
希望你把 资料的网址贴上来。。

阿曼达245

我们科的前辈做法是修复完了不冷却直接蒸馏水洗一两分钟后，PBS 洗。
是修复完之后修复液与PBS交叉反应，是在工具书上写的，明天我抄下书名，谢谢您！

[ 本帖最后由 阿曼达245 于 2013-11-24 21:05 编辑 ]

willfirm

建议 还是等修复液自然冷却至六十度后，取出放到水下冲泡，然后转到PBS中。这样的片子修复效果比较稳定。

dingwei

修复完之后修复液与PBS不会有交叉反应，问题出在修复完了没有冷却：可采用自然冷却，也可以直接用自来水冲凉。如果片子是热的，在拿出来的过程中片子快速干燥，抗原瞬间破坏，造成切片部份或全部阴性。

willfirm

1991年石善溶的第一篇关于抗原修复的文章有提到，温度是抗原修复的重要影响因素，基本可以认为达到预期效果的修复时间与温度成反比（同样的修复液）。高压修复中，停止加热后，高压锅内温度会从120℃很快的下降。这个温度下降过程对修复效果的影响较小（参考“90℃修复抗原需要过夜”可以作此猜测），但是不能忽略的！最重要的是，这个过程是很温和的，不像你拿自来水浴那么“猛烈”。“猛烈”的过程是不容易控制的，比如你的自来水的温度，体积，与高压锅的接触面积，这些因素对吸热过程都是有很大影响。
       有人提过一个观点，就是蛋白质在60℃下即开始变性。免疫组化组织修复的原理尽管还不是很明确，但是我们可以考虑，脱蜡-水化-修复的过程就是蛋白质一定程度的复性，所以这个复性过程一定要降温到60℃以下再终止。
       总之，不管出于避免干片，过程可控还是修复尽可能充分的目的，修复之后一定要降温到60℃以下，这样才能保证修复过程的稳定。
       免疫组化最重要的是稳定，而不是速度，毕竟不是冰冻快速。

[ 本帖最后由 willfirm 于 2013-11-25 12:58 编辑 ]

dingwei

自然冷却与快速冷却我做了做多实验对照，我自己的结论并不是那么回事：
自然冷却，在相同修复时间下结果比自然冷却强，因为从120度到室温（60℃的片子拿出来只要放得慢一点，也容易干燥，也会不着色）需要一定的时间，说白了就是切片在自然冷却过程中还在高温下修复。
快速冷却，立即中止反应，并没有出现影响抗原的现象，如果增加一点修复时间，然后快速冷却，同样也能达到与自然冷却相同的效果。
而且抗原修复很难用充分的概念，只是相对而言：少了会不足，增加一抗浓度会达到好的结果，同样，过一点，可降低一抗浓度，当然这也要一定的度。所以稳定的抗原修复方法最重要。就象你说的“自来水的温度，体积，与高压锅的接触面积，这些因素对吸热过程都是有很大影响”，其实你没考虑到自然冷却与室温、体积、高压锅的大小有很大的关系，而且经历时间长，变量大，影响也更大。而用自来水冲，作用时间短，变化小，影响因素就小。
对于抗原修复的理论到现在为止都是猜测，石善溶也只是从一个误操作中发现了其中的变化，并不知道其真正的原因，而且高温修复早就违背了蛋白质变性的理论，因此，也不能简单用蛋白质变性的理论去解释。DNA在解链后快速冷却可以阻止双链的复合，难道就不能出现某些抗原决定簇在打开后也有回复的可能？一切都是浮云，一切都有可能。
所以，我们只能用实验来证明其种现象，找出怎样做出稳定结果的规律。然后，经过大量的实验，才可能找出抗原修复的真正原理。

阿曼达245

十分感谢前辈们在这给出的解释和建议！新手还是等自然冷却了到60度再做比较稳妥。
看到交叉反应的出处是《免疫组织化学 病理诊断》主编吴秉铨 刘彦仿 北京科学技术出版社 。原话是：“AR 加热处理前后，应用蒸馏水洗净切片，以防所用AR溶液与其他缓冲液发生交叉反应。”

willfirm

另外，你提到的那本书说的 是“AR前后”，我的理解就是，比如有人脱蜡-水化后，放到 缓冲液中清洗，如果这时把切片移到修复液中，残留在切片上的缓冲液就会混入抗原修复液，这时这两种缓冲体系肯定会有一些所谓的“交叉反应”。。。但我觉得，这种交叉反应，微乎其微的，因为切片上残存的修复液相对来说太少了。所以，所谓的“交叉反应”可能主要是说“AR之前”而不是“之后”。


其实，在实际操作中，根本没有必要在修复前用缓冲液冲洗。直接拿自来水冲洗就行了，不会有什么影响。

willfirm

但是，最后丁老师的总结道出了免疫组化这个对实践性要求很高的技术的内涵。
免疫组化的原理是捉摸不透，难以解释的。
      “不管白猫黑猫，捉住老鼠就是好猫”，找到合适你的方式，合适你们科室的方式，做出稳定（室内质控方面）准确（室间质控方面）的片子，你就离优秀技术员不远了。
我们通过大量的实验对照，可以排除一些免疫组化的不良影响因素，至于免疫组化的原理探寻，很难很难，而且，看的文章越多，越糊涂。很多不同的实验推导出的结论都是相反的。