fzxd888

从许多研究生实验动物标本取材情况来看，都不是很理想，原因最多的是放血后取材，直接导致组织细胞因缺血缺氧后出现的细胞死后变化，线粒体、内质网等膜性结构的水肿变性较常见，干扰了观察结果，导致一些不科学的形态结果。如果想在很短的时间内进行多器官取材，目前除了全身血管灌注固定以外，还有一种方法值得大家试用，就是结扎血管取材法。就是将要取材的器官游离出来，用线或血管钳阻断血流，再将该器官切取下，迅速放入固定液中修块成1立方毫米左右的若干小块，这样取材后再进行采血操作可能是比较好的结果。如果认为这样采血效果不好，那么，在实验期间应多增加几只实验动物专做电镜用，这样可以保证电镜标本的取材。以上方法仅供参考。

lijiahua

认真学习了

aimamala

最近要做培养细胞的透射电镜样本，经验不足，特向版主求教！
我按以下流程可行吗？步骤是否有遗漏？顺序上是否合理？
培养瓶培养的细胞取材：1、加入胰蛋白酶消化液，让附壁细胞脱壁；2、将细胞悬混液装入玻璃试管，3000转/分，离心10分钟；3、弃去上清液，加入4摄氏度2.5%戊二醛，固定30分钟；3、弃去固定液，加入缓冲液漂洗5分钟，3000转/分，离心10分钟，弃上清，反复3次；4、加入小牛血清，混匀，3000转/分，离心10分钟，弃上清；5、加入2.5%戊二醛，固定1小时。
是否应该在第2步时就加入戊二醛比较好呢？因为离心10分钟，我担心细胞会有形态改变。

fzxd888

培养细胞的固定在胰酶消化后先用生理盐水做成悬液，然后离心沉淀，弃上清液后加入戊二醛固定液，然后用吸管吹气打碎细胞团，让细胞固定充分（30分钟-60分钟），然后离心成团，如果细胞团大于2mm，建议用刀片切成2份，分管固定。用血清作为预包埋细胞团，最好将细胞团游离于血清液中15分钟后吸取血清，要留一点血清，然后加入固定液于冰箱内固定过夜即可。在后续处理中应保证细胞团不分散，如果不能成团，只能每一步都要进行离心沉淀处理。以上建议，仅供参考。

aimamala

谢谢版主的指点！有人说胰酶消化后的细胞就变圆了，形态不好
可以把培养液倒掉，PBS液涮洗三次后，加入固定液固定30分钟，然后刮取细胞，离心沉淀，加PBS液清洗2次，后加入血清混匀离心，再次加入固定液，大的团块改小即可。
这样细胞形态更好，是否是这样呢？内心很矛盾！请指点！

lijiahua

分享了，

fzxd888

细胞培养是实验最基础的实验手段，如何制好细胞包埋块，却不是一件容易的事情，现在介绍一种方法，大家试试。
一、透射电镜处理：1、培养瓶内细胞培养的，先将培养液倒掉，用生理盐水或缓冲液漂洗一次，然后将固定液倒入培养瓶内将细胞全部浸入固定液内约半小时，然后用胰酶消化处理，将消化下来的细胞离心成团，根据血清预包埋法进行处理即可。2、载玻片培养的（光滑面），将玻片用生理盐水漂洗干净后，用刀片沿着玻片边缘切割出矩形细胞片，再用固定液浸泡30分钟，然后在冷的生理盐水中摇换，使细胞片自然脱落，如果不能自然脱落，可用镊子及刀片协助剥离。这种处理方式可很好地观察细胞间的连接情况。然后按常规方法处理。
2、扫描电镜处理：1、培养瓶内细胞培养的，用生理盐水或缓冲液漂洗一次，然后将固定液倒入培养瓶内将细胞全部浸入固定液内约半小时，然后用胰酶消化处理，将消化下来的细胞离心成团，然后常规处理，但这种处理方法容易将细胞表面结构造成破坏。2、破坏性处理：先用生理盐水漂洗后将玻璃培养瓶打碎，取出1-2厘米大小的碎片（有细胞）浸入固定液内固定30分钟，进行常规操作处理，用冷冻干燥法干燥。3、盖玻片（1cm）细胞培养:将细胞直接培养在盖玻片上，清洗干净后按常规方法处理即可，冷冻干燥法干燥。载玻片培养的应该将玻片切割成1cm大小进行处理。这种处理方法可以很好地保存细胞的培养时的形态。以上方法，仅供参考！

[ 本帖最后由 fzxd888 于 2017-11-23 10:54 编辑 ]

fzxd888

从目前的情况来看，电镜标本取材还没有一个规范性操作标准，由于科研项目的要求不同，取材方式会有些许差异。但是电镜取材与光镜取材有着明显不同之处，由于电镜观察的局限性以及很高的一致性-即标本经过固定后与生活时的状态要非常接近，需要在尽可能短的时间内标本得到固定，因此，电镜取材才会有“快、小、冷、准”的要求。但是，很多学生对这个要求理解不透，取材失误也就在所难免了。有些学生担心取不到需要观察的位置，因此就取得较大一块标本，最终导致标本固定不良失去了观察意义，费时费力却得不到结果，白忙活！因此，任何生物标本必须严格按照上述四个要点进行，如果真的做不到“快”，但至少要做到“小”，小是最关键的要求，即标本的大小要小于1毫米，在保证取材部位准确的前提下尽可能的“小”，标本数量尽可能多些，这样就可保证标本的完整性。因为每个包埋块都要先进行半薄切片观察，总会找到需要观察分析的位置。其实那些取得较大块的标本只要多切几刀，分成若干个小块即可，其实这个操作并不难！这也说明大多数学生对取材和结果相关性的认识不够，对取材的重要性没有引起足够的重视有关！

黑龙江羔羊

谢谢

fzxd888

细胞培养是一个细活，条件苛刻，需要一丝不苟的态度和深厚的技术积累。由于影响培养细胞的固定质量的因素较多，应该引起大家的注意，比如PH值、渗透压、浓度以及配方溶剂性质等，其中固定液PH值的影响常常被忽略了，我们知道，大多数细胞属于PH值7.0范畴，但有些细胞适合酸性环境比如胃、小肠上皮细胞，肾组织偏酸性，则固定液也应该调整相应PH值。有些细胞适合于高渗环境，比如海洋生物细胞，有些适合于低渗环境，比如淡水生物细胞，故固定液也需要相应调整！我们常规的戊二醛固定液PH值大概在6.8-7.2之间，适合于大多数细胞。对于培养细胞，固定液的浓度可以稍降低一些，比如1.5%。大家可以根据细胞培养液的相关指标对固定液作相应调整。对于贴壁培养细胞来说，最佳方法就是在载玻片上培养-原位常温固定-低温轻推刮取-离心沉淀-血清（蛋清）预包埋预固定。目前不提倡胰酶消化作常规电镜观察！