lpfhct

冰冻如何做出接近石蜡的效果（花费时间再长都可以）

各位老师好，我是一名刚接触病理技术的研究生，现遇到以下问题：
我们实验室只有冰冻切片机（机器是很老的那种，山顿牌的），没有石蜡切片机、展片机之类的，现在老板要求我们最好能利用这台机器做出石蜡切片那样的效果，我们就试着做了如下几个实验：
1、新鲜皮肤、肝脏组织各一块，5-6微米切片，酒精固定，60℃苏木精30秒-60秒，水洗，温水蓝化数秒，伊红2-5秒，酒精脱水数秒，二甲苯透明数秒，树胶封固。
结果发现片子比较模糊，没有石蜡那么透亮清晰，细胞与细胞分界不太清，细胞核也模糊，都有点“毛茸茸”的感觉，尤其是皮肤毛根部的细胞几乎融在一起了；肝脏组织里面还有大量空泡（不用二甲苯的话，空泡就没有了）；而且老板说颜色还不太对，说红的地方太红，蓝的地方太蓝；
2、为了消除那种模糊的感觉，我们就想通过“先用冰冻切片机切片，然后把片子按照石蜡的步骤走一遍”，同时按冰冻切片的步骤作对照，看效果是不是好一点，于是我们把切好的皮肤、脾脏、肌肉、肝脏各一张冰冻切片切好后置小型染色缸，丙酮中固定5分钟，70%-100%酒精脱水各5分钟，二甲苯透明30秒左右，将整个片子浸蜡约1小时，然后二甲苯脱蜡5分钟四次，100%-70%酒精逐级脱蜡至水各5分钟，蒸馏水5分钟，苏木精10分钟，水冲半小时，盐酸分化约5秒，水冲30分钟，70%、85%酒精各5分钟，伊红染色15秒，90%-100%酒精脱水各5分钟，二甲苯透明各五分钟，树胶封固。另一组则丙酮固定后，直接蒸馏水5分钟，苏木精10分钟，水冲半小时，盐酸分化约5秒，水冲30分钟，70%、85%酒精各5分钟，伊红染色15秒，90%-100%酒精脱水各5分钟，二甲苯透明各五分钟，树胶封固。
结果两者没有什么区别，都是模糊的，而且骨骼肌组织的细胞核好像都跑到细胞外去了；肝脏倒没有什么空泡，但整个结构不太清楚；脾脏大体结构是清楚的（白髓、红髓、小梁、脾小体等都能识别），但有点乱糟糟的感觉；两者的区别好像在于对照组更容易掉片（问了一位有经验的、专门做科研病理的技术老师，他说如果急着染色的话，切完片子之后就放到37℃恒温箱5分钟，如果不急着染色话，可以放在常温下，待玻片上的水珠都没有的时候再放37℃恒温箱5分钟，有其他事情需要处理的话，甚至还可以放在4℃冰箱过夜。但他没有说是否需要先固定）；
他还解释片子模糊的原因可能是取材组织本身没有固定的原因，所以细胞分解造成的，他建议可以取材后直接甲醛固定（就像石蜡一样），然后再冰冻切片之前用30%蔗糖脱水直到组织沉下去为止，再冰冻切片；他还建议后面最好还是“慢慢染色”，“快速染色”的效果他之前做好像都不太好。（这位老师是一名有丰富经验的技师，而且只做科研的，和临床病理都没有接触的，很多东西也是自学成才的，文化水平是初中，所以我们稍微有那么一点点怀疑，而且他也没有做过）

总的来说，这两种费时较多的染色方法比上述的“快速染色”在染色上要好一些，但透明度和清晰度还是不如石蜡切片；
3、我们老板后面还要求做免疫组化，但免疫组化老是做到一半就掉片，我们现在用的是一般的片子，先37℃晾干再固定（好像这样理论上对组织影响大，但那位老师说他的经验发现两者出来的片子差不多，有时先固定的效果还差一点），他建议我们可以先在玻片上涂多聚赖氨酸试一试；没有掉片的，最后做出来的结果也不如人意：一是阳性很少（怀疑假阴性），二是有阳性的地方好像定位也不太对（好像在细胞外）；那位老师解释说可能还是跟组织本身有关，比如冷冻不及时（我们用的标本是2天前用于实验HE的组织，做完HE后直接冻在-20℃冰箱，中间好像又一次冻融）造成细胞组织的破坏，抗原弥散到胞外，同时他说我们切片后的甲醛固定也可能造成“阴性”结果；


我想问的问题有：
1、上述操作步骤有没有严重错误，有的话请帮忙指出一下，毒舌一点都无所谓，晚辈是初学，需要批评和教育；
2、上面那位老师的建议是否可取，或者有什么值得商榷、改进的地方？
3、我们现在仅仅是为科研所做，所以我们追求的是片子的质量，花多长时间都无所谓，不像临床那样需要急着出报告，所以有什么好的方法能提高片子质量的，直接说就行了，时间再长都可以接受；
4、我们做皮肤病理比较多一点，关于皮肤这一块有什么需要注意的地方？

问题有点多哈，各位老师可只回答自己感兴趣的部分也可以！先谢谢了。

6504339

动物实验？拿我们做的大鼠来说
1.新鲜组织应该用OTC包埋，放入液氮中速冻后-80度保存，而非-20度，组织都 坏了，注定实验肯定失败！
2.皮肤应该按切脂肪的 温度来设定，因为皮下组织含有大量脂肪，肝脏最好用速冻头快速冷冻避免冰晶化
3.冰冻切片固定直接染苏木素，10min(不知你们用的什么苏木素要这么长时间）一般4分钟左右，60度30s  的方法 我们没做过，但还是问问为什么没有分化这步？流水反蓝的时间太长一般5分钟左右，伊红不知道你们 是用的醇溶性，还是水溶性。
4.肌肉的细胞核在细胞外，可能是 横切造成的假象！
5.免疫组化最好用挂胶片，自己涂多聚赖氨酸，或者买现成的！影响免疫组化结果的因素太复杂，不好 说，就你的而言应该是前期组织没处理好更多一些！！



PS：那位老技师说的都是很有道理的 ，文化水平并不代表一切，实践经验有时候比书本知识更实用！

lpfhct

谢谢哈！
1、开始的HE是一取出来就速冻冰冻切片的哈，没有-20℃；后面的免疫组化用的是-20℃冻过的；
2、温度好像没有达到脂肪的温度：肝脾肌肉用的-18℃，皮肤用的-24℃；
3、“冰冻切片固定直接染苏木素”（又学到一点新技巧了哈，不过不知道有没有相关解释？）；常温染的话，用的是10分钟苏木素+半小时水冲+数秒盐酸水溶液分化+半小时水冲+70、85酒精各5分钟+伊红水溶液15秒+95、100酒精、二甲苯、封片；60℃染的话，就30秒苏木素+水冲数秒+温水分化（不用盐酸分化）+伊红醇溶液2-5秒+水冲+酒精、二甲苯、封片；那位老师的解释是说苏木精染色时间短的话，就不需要用盐酸分化了，用水让其自然返蓝就行了；
4、个人认为：如果是横切的话，肌细胞胞核要么不在，要么在细胞边缘，而不是在细胞外；（那位老师看不懂片子，但听我说了正常应该是怎样的之后，他说可能是细胞结构被破坏造成的，我也不知道是否正确）
5、看来还是要涂多聚赖氨酸哈；
6、今天向那位老师还学了一点小窍门，也不知正不正确，拿出来分享一下哈：染色后的片子可以不用酒精逐级脱水了，直接烤一烤（他用的是60℃左右的烤箱），然后进二甲苯、封片；
7、麻烦再问问楼上这位老师，你们用冰冻做出来的片子有石蜡那样清晰透明么？你认为我现在遇到的问题除了操作不熟练之外，还有什么比较严重的错误或缺点？

再次感谢！

6504339

一般来说，冰冻切片要做成跟石蜡切片一样清晰透明，很难！
免疫组化的组织是做成切片固定后放-20还是组织直接存？肝脾肌肉我们设的是-20，脂肪-35
甲醛固定液的大分子可能会与组织末梢的蛋白质发生过度交联，掩盖抗原决定簇，造成免疫组化的假阴性，换4%的多聚甲醛会好一些。要高质量的切片，苏木素染色还是分化好些，否则容易核浆共染，HE染色液应该按步骤脱水，透明封片，放烤箱烤，容易引起细胞萎缩！挂胶片直接买现成的吧，太阳生物的AEPS不错，玻片很干净！肌肉可能是切冰冻切片的时候冰晶化了，细胞自溶！

qius

苏木素后用1%盐酸酒精分化1秒再流水蓝化

lpfhct

再次谢谢老师的帮助哈！
看来冰冻想达到石蜡的希望是渺茫的，科研的话还算是用石蜡最好（部分容易被破坏的结构或酶除外）；

今天又在那位老师那里学到了一点石蜡的技巧：
苦味酸可以让组织柔韧一点，便于切片；
脑等细胞密度不太高的组织，分化时间要相应的短一点；

dingwei

冰冻切片应该与HE切片相近，大多数冰冻片子都能达到这样的效果，而且染色更鲜艳。只有含水量多的组织不容易做好，冰晶不能去除。冰冻切片的关键是方法要正确，规范的操作，所谓的很多小窍门有的是错误的。网上的东西只是一个参考，更多的是应该学习专业的书籍，否则容易误人子弟。书上的知识绝大多数都是正确的，只是我们没有理解和正确的操作。而所谓的实践经验往往偏差很大，这也是中国病理技术质量普遍偏低的原因。你是一个研究生，更应该好好的研究方法的正确性与实际工作中的差异，不要轻易下结论。这才是中国病理技术的希望。
至于冰冻切片做免疫组化，由于抗原弥散，其定位没有HE好，也就是常说的敏感性好，特异性差。容易掉片是因为冰冻切片要用凝固性的固定液：如甲醇、丙酮等。
有关冰冻切片的制片，我写了一点，不全正确，你可以参考一下。http://bbs.dingw.com/thread-9539-1-1.html

lpfhct

谢谢老师的批评与指点。
1、现在的老师、教授中热衷于“教书育人”的不多了（大部分都钻研自己的临床、科研、文章、收益之类的，真正的教授大多一年就那么几次授课而已），能遇到把教育也作为己任的老师内心很感激，衷心感谢！；
2、之前我用的是龚志锦、詹荣洲老师编的《病理组织制片和染色技术》，书有点老，是我们实验室的公用书，上面大部分讲的是技术层面的东西，理论层面的涉及较少，所以一直有很多疑惑，再加上自己没有多少怀疑的精神，最终偏听了“小窍门”；今天我去借了一本王泊云老师主编的《病理学技术》回来学习，相信会有所进步，希望不辜负老师的希望；
3、《全国冰冻切片比赛获奖名单和点评（重编：带问题切片照片）》已经学习过了，也学到了不少东西，很是敬佩老师的专业技术和职业精神。
4、作为初学者，除了想看看做得不好的片子，其实更想看做得好的（因为我这几天做出来的片子，有的人说不好，有的人说好，其实我自己都不知道自己做得好不好，所以才问他们），不知道怎样才能看到大赛获奖的片子？
5、关于“冰晶”，看了两位老师的讨论，也获益匪浅，但也产生了一个新的问题：在培养细胞的时候有一个原则叫“慢冻快融”，其中“慢冻”的目的是为了减少细胞内冰晶（增加细胞外冰晶形成，总的来说还是冰晶增加，与“慢冻增加冰晶”的结论是一致的），其原理在于“慢冻”可以使细胞内的水分逐渐渗出到细胞外（加之保护剂可以降低冰点、增加膜渗透性，使水到胞外更彻底），胞内水分减少也就代表最后形成的冰晶减少，也就是对细胞损害越小。问题在于细胞冻存为什么不采用“快冻”的方式（比如直接进液氮）来减少冰晶呢？
6、关于比赛，我还有一点疑问就是“比赛用的苏木精是哪种配方，为什么必须要3-5分钟呢”，是因为这种苏木精的染色效果好，还是单纯的想考一考参赛者对时间的分配、管理能力？

dingwei

比赛用的苏木精是北京一个厂家提供的，具体配方不清，着色能力较慢，所以要3-5分钟。并不是想考参赛者对时间的分配、管理能力。但作为一个选取手，应该考虑各种到可能会变的因素，碰到具体问题能够具体解决，不是死板地重复。
细胞冻存我没有经验，是不是采用“快冻”的方式，会使细胞内的水份留在细胞中，所以采用慢冻的方式？