dingwei

2007年，一个偶然的机会，我发现有家医院的免疫组化结果：Ki-67，P53，ER、PR等阳性细胞数有点少，大概只有30-40%，如果是一二例，结果应该没问题，然而一年以来都是这样，而CK、EMA、CD20、CD79a、CD45，CD45ORO等浆与膜表达的标记很好，感觉告诉我那里出问题了。他的操作过程是：
1、脱蜡至水
2、甲醇双氧水阻断。
3、蒸馏水洗
4、用电磁炉最大档或中档加热，因处理片子不多，在高压锅里放上蒸馏水，里面放一500ml烧杯，烧杯里放300ml 柠檬酸ph6. 0抗原修复液，把片子放在烧杯里。加热戴帽出气后3分钟，关闭电磁炉。
5、自来水冲高压锅快速冷却，打开高压锅盖，用冷水慢慢冲入高压锅内至冷。
6、蒸馏水洗
7、缓冲液洗三道
8、加一抗（37℃孵育60分钟）
9、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
10、加EnVision检测系统（37℃孵育30分钟）
11、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
12、DAB显色。
问题出在那呢？那只有一条一条去排除。
一、碰到这样的情况我本应该首先考虑是不是一抗出问题了，但他们用了一年，一抗换了几次了，所以我想是不是组织处理导致其些抗原丢失了。所以，让他切了几张片子，我拿回自己科室做了一下，发现阳性率在80-90%左右，也就是说组织是没有问题的。
二、要考虑一抗是不是有问题，如果是原液，应该考虑稀释比对不对，如果是即用型，应该考虑有效期、厂家有没有配正确、运输过程中有没有出现意外等。用其的一抗与我们的检测系统配合，实验结果阳性很好，一抗没有问题。
三、考虑检测系统有没有问题，不同的检测系统，敏感度不同，相对应的一抗浓度也不相同，要考虑检测系统与一抗浓度是否相配，同时也要考虑质量有没有问题。用其的检测系统与我们的一抗相配，与他自己的一抗相配，实验结果阳性也很好，检测系统没有问题。
四、抗原修复有没有问题？抗原修复液是否有效？pH值是否正确？高压锅有没有问题？结果都没有问题。
五、缓冲液是否有问题？是否因为蒸馏水pH值不对？结果都没问题。
六、DAB有没有问题？结果没有。
七、技术员操作有问题？我亲自到他们科室去做，结果和他做的一样，回到我科室又好了。
能想的问题都想到了，那还有什么我们没有想到的呢？
唯一区别的只有加热工具了，我们用电炉加热，他们用电磁炉，从理论上说，不管什么样的加热工具，只要能达到温度，高压锅出气戴帽后，里面的温度是恒定的。抗原修复应该与温度与时间相关。抱着试一下的心态用让他用电炉试了一下，没想到问题解决了。
是电磁炉的原因，我很兴奋，终于解决了，是什么原因呢？我特意买了只电磁炉，从400W开始到2100W，每一档都用了二十几个抗体做了实验，并与电炉作比较：发现凡膜与浆的抗体基本没有差异，而核抗原随着电磁炉的功率的增加，阳性细胞数减少，阳性强度降低。我重复了十几次，结果都是一致的，问另一个用电磁炉修复的医院，方法也和前面医院的相同，结果也一样，换了电炉后问题也就解决了。
我相信自己已经找到问题的所在，是电磁炉的原故，那什么原因呢？为什么只出现在抗里呢？我上网查了一下，发现有十几万篇有关电磁波对DNA损伤的论文，是不是电磁波破坏了DNA，从而损伤了抗体的活性呢？如果是这样，那就解释得通为什么功率越大，阳性细胞越少。于是，我写了篇文章，有关电磁炉对抗免疫组化的影响，但有些大医院的技术员说他们也用电磁炉，没有发现这种现象。我充分相信自己的结论，因为这是一年以来用电磁炉后存在的现象，自己做了十几遍重复性在100%。总认为他们肯定没有做过与电炉的对照，而且，电磁炉对核抗原的影响只是细胞的减少，并不是完全没有，具有欺骗性，他们没有发现而以。一年来，我总是相信自己的结论，对别人的意见不予理睬，因为没有人告诉我他们做过对照。
然而，多次与梁英杰老师交流，他说他们曾做过实验，电磁炉与微波炉比较，电磁炉比微波炉强，想起一年来别人的不同意见，这让我对我的实验产生了怀疑。中华病理杂志的霍临明老师告诉我实验要严谨，让我彻底冷静下来。那问题到底出在那呢？
经过一天二夜的冥思苦想，我终于想到了自己实验出现这种结果的原因，是一个从来都认为不可能有区别的地方。通过反复实验，证明这种想法是正确的。为了科学的严谨,我立即给SCI收录的美国Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology杂志写信，撤回了已经三次修回待发表的文章。
什么原因，我现在不想说，希望你们也能想一想，这对你们以后解决问题有好处。
我想说的是，为什么一年多来，面对别人的不同意见我会如此自以为是，总认为自己是对的，如果早一点重视，一个错误的观点也不会坚持了一年多。这是过于自信了，这就象很多的技术员总觉得自己做的不错，自己做的就是正确的，对别人的意见听不进，特别是有大医院的和有点年纪的，就象我。
虚心使人进步，骄傲使人落后，重视别人不同意见，接受别人的看法，才能使自己少走弯路，才能使自己不断进步，这需要勇气和智慧。
我把这句话作为新年祝词，与朋友们共勉。

ChenRong

会不会是电磁炉抵挡和高档的时间上面的问题？

秕谷

秕谷

丁老师，您好！我是温岭中医院的，昨天还碰到您父亲了，和他聊了几句。在新的一年里，祝您和您的家人新年快乐！万事如意！昨天我们的一个在你们那进修的同事带回来在嘉兴开会的资料，上面有您的一篇文章，我和主任还讨论了一番，今天一早就又看到您这篇文章了。可以说，我们也是用电磁炉的，方法几乎和上面您说的那家医院一样，当然我们碰到的问题也一样，现在感觉您已经找到答案了，急切的想知道，私下告诉我也行，我的QQ是104349015，技术群里有我的，本来我是沙发的，刚出了点意外估计就板凳了，新的一年板凳也是不错的，就是有点凉

秕谷

难道是高压锅里再用烧杯的原因？实在想不出还有什么不同了

ChenRong

引用:

原帖由 秕谷 于 2009-1-1 10:54 发表
难道是高压锅里再用烧杯的原因？实在想不出还有什么不同了

丁老弄的是3人沙发，大家一起坐，暖和点。
多个烧杯有这个可能，就像做炖蛋时加个碗，可以均匀的受热，里面的洞洞少点。原理差不多。
等待佳音。。。

dingwei

就是高压锅里再用烧杯的原因，由于电磁炉加热太快，烧杯内的温度与高压锅内的液体温度不能同步，导致必须使用高温修复的抗原修复时间不够，功率越大，加热速度越快，抗原暴露也越差，而用电炉加热较慢，有足够的时间让杯里的水温升高，也就没有这种情况。所以电磁炉抗原修复应该直接将缓冲液放入高压锅内，而且结果与功率无关。一种巧合，正好这些需要高温修复的抗原大多是核抗原，让我误认为电磁波对核抗原有影响，而国外对电磁波对人的影响很重视，电磁波的确对活体的DNA损伤很严重，而且我的实验结果又很稳定，所以我一直坚持自己的错误观点，哈哈。今天终于搞清楚了。

ChenRong

有错就要罚，就给我们一人寄个电磁炉吧，好暖暖

秕谷

那还有个问题想和大家探讨一样,就是怎么样才能用电磁炉做出好片子呢?照这个原因是不是改用低档或是不用烧杯直接放锅里呢?直接放锅里我感觉容易掉片,掉片可是一件很让人烦的事,那我看以后就用低挡慢慢加热看看,真所谓慢工出细活,看来我们搞免疫组化的人急不得啊,不知道大家有什么好办法呢???

dingwei

组织处理好不会掉片，我们一直都是直接放锅里。