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前言
近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。做过病理实验的人都知道，真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。一味按照网上操作流程来做，最终结果往往并不是十分理想，达不到预期的效果。分享一些宝贵经验，希望对大家有所帮助。
认识免疫组化
是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
操作要点和技巧
1、固定：最好用4％的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠－赖氨酸－多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2、组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切
3、切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4、烤片：60℃30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5、蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
6、脱片问题：Poly－L－Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1：10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly－L－Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES1：50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7、灭活内源性酶：HRP系统：3％双氧水灭活；AP系统：3％HAc灭活。
8、暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度（不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书）。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9、封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭。
10、抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11、背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
12、返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13、显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
实战经验总结
1、其实免疫组化，的关键是结果出现异常时该如何去解决。首先需要掌握好免疫组化实验的原理，知道每一个操作步骤的目的，这样你才能大胆地去改革和纠正一些错误的步骤，如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。比如温度有4℃、室温、37℃。推荐4℃最佳，反应最温和，背景较浅；而37℃反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、实验方法需要动手和动脑。经过了反复的动手和动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。
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本帖最后由 阡陌未知 于 2015-10-10 09:50 编辑 ]
