zxx9

我最近购买了新二抗（与以前所用的同一公司）、新的DAB显色组合（以前是自己配制，然后过滤），将1月份切的组织片用同样的方法试染了一次，结果同一组织以前染色阴性的地方都变成阳性了，几乎没有阴性，背景也较高；而阴性对照则正常。请问：
这是不是就叫假阳性，主要问题出在哪个环节，该如何纠正？

shanghainese

如果您愿意的话，请您做下面的实验并把结果告诉我。
第一张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，自己配制的DAB。
第二张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，自己配制的DAB。
第三张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，新的DAB。
第四张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，新的DAB。
第五张切片，PBS，原来的二抗，自己配制的DAB。
第六张切片，PBS，新的二抗，自己配制的DAB。
第七张切片，PBS，原来的二抗，新的DAB。
第八张切片，PBS，新的二抗，新的DAB。
第九张切片，PBS，PBS，自己配制的DAB。
第八张切片，PBS，PBS，新的DAB。

fangdang

shanghaiese老师设计的试验将会揭露你试验中所存在的所有问题了。

zxx9

shanghaiese老师:您好!
我按您的设计进行试验，结果如下： (由于我没有这么多一样的组织片，下列切片不是来源于同一蜡块，仅1.2同一来源切片，3.4同一来源切片，5.6同一来源切片，7.8同一来源切片，9.10同一来源切片。)
第一张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，自己配制的DAB。
阴性、阳性均有
第二张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，自己配制的DAB。
阴性、阳性均有
第三张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，新的DAB。
几乎全阳性
第四张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，新的DAB。
95%以上阳性
第五张切片，PBS，原来的二抗，自己配制的DAB。
阴性
第六张切片，PBS，新的二抗，自己配制的DAB。
阴性
第七张切片，PBS，原来的二抗，新的DAB。
阴性
第八张切片，PBS，新的二抗，新的DAB。
阴性
第九张切片，PBS，PBS，自己配制的DAB。
阴性
第八张切片，PBS，PBS，新的DAB。
阴性
另外我做了一组用30倍稀释的DAB(其他都是20倍稀释)，是去年7月份切的片子，两片不是来源于同一蜡块，其他同第3、第4片，结果为阴性、阳性均有。
根据这个结果是否可以认为问题在于DAB浓度过高。

shanghainese

怪我没说清楚，没让您彻底明白，请您原谅。我的本意是这所有的片子都应该是同一蜡块的，这样才能比较。
请您用显微镜看一看，第一张切片和第二张切片，第三张切片和第四张切片，它们的染色是否一致。它们的染色强度是否一致。如果一致那么您的二抗和DAB就没问题。
背景高和您的一抗，二抗浓度过高有关，与您的抗体孵育时间过长温度过高有关，如果您的DAB显色超过5分钟也会产生高背景。

zxx9

shanghaiese老师:您好!
非常感谢您的帮助！
因为我们实验室自已没有切片机，在切片上很不方便，所以只用先前剩下的切片实验。
由于有部分掉片，两片的组织结构均不全，很难一一对比，只好把染色位置分为胞核、胞浆，把DAB显色强度分1-5级，这种情况下，
第一张切片和第二张切片的染色位置一致，染色强度基本一致（不完全一样，但在同一级，2级）。
第三张切片和第四张切片，胞核、胞浆全部显色，所以染色位置一致；染色强度不一致，第三张切片约为5级，第四张切片约为4级。
老师，如果二抗和DAB试剂均没问题，只是DAB浓度的问题，那为什么第四张切片有那么强的非特异性反应，而同第四张切片一样试剂的阴性对照一点非特异性反应都没有。（这次实验所用切片之前均有染过，都正常，阴性、阳性均有）
再次谢谢您，也希望再次得到您的帮助。

shanghainese

我没有看过您的切片，也不知道您的蜡块组织的质量任何？难判断。但我感觉你的第一，第二张切片与第三，第四张切片的质量相差很大。因为“第三张切片和第四张切片，胞核、胞浆全部显色，所以染色位置一致”而第一，第二张切片没有这样的现象。我认为这才是造成您背景高的主要原因。
“染色强度不一致，第三张切片约为5级，第四张切片约为4级。”是因为它们的二抗有些差异。
您新的二抗问题不大，但我不知您用的浓度是否很好。这一点你可以查查说明书等等。
看来您新的DAB没有您自己配制的好。
您问为什么第四张切片有那么强的非特异性反应，而同第四张切片一样试剂的阴性对照一点非特异性反应都没有？
因为DBA的反应需要HRP(辣根过氧化酶)的作用。而阴性对照是没有HRP(被洗掉了或没加)，所以看不出DAB的好坏。

zxx9

shanghaiese老师，谢谢您！
我用的是皮肤组织，蜡块组织的质量不大好。
我的二抗是“ready to use"的，可能不同批次的差异。
依您看，如果在DAB的浓度上进行试验，是否会让问题更明确。
选6张同一蜡块的切片，
第一张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：20）。
第二张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：40）。
第三张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：80）。
第四张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：160）。
第五张切片，用原来的一抗，原来的二抗，自己配制的DAB。
第六张切片，用原来的一抗，新的二抗，自己配制的DAB。
第七张切片，PBS，新的二抗，新的DAB（1：20）。
您看是否有这个必要，或者其他建议。

shanghainese

您可以也有必要调整试剂包括一抗，二抗，Streptavidin-HRP, DAB的浓度，找到最佳浓度。
但是如果蜡块质量不好，您是无法做出好的结果来的，这不是背景高和试剂不好的问题。

闲云

如果你的一抗灵敏性很高，我觉得你可以尽量稀释，上千倍都可以，我都用过一种抗体，就是这样的，对结果也没什么影响！