bananalcx

   我是在读学生，课题中涉及大鼠脑组织BrdU的免疫组化检测及双标染色，BrdU是在大鼠形成梗死模型后6；6、13；6、13、20；6、13、20、27d（4个组）注射，注射日注射3次，间隔8小时。注射后24h取脑冰冻切片，根据文献抗原暴露用HCI及/或胰蛋白酶，还有用甲酰胺、硼酸处理，我也试过，但一直没出结果。一抗用的是博士德分装，其它用的是中山公司SP免疫组化及显色试剂盒,通用型的，请丁老师及各位帮忙指点迷津，本人不胜感激！
   另外，双标试剂盒哪个公司的更可靠？

shanghainese

您可换用 BD Biosciences 的 BrdU 免疫组化试剂盒。联系地址：
BD广州办事处
广州市东风中路410-412号
健力宝大厦1208室
510030, 广州, 广东省
Telephone 020-83486363
Facsimile 020-83486377

bananalcx

我是抱着试试看的态度来询问的，没想到这么快就得到答复，我很庆幸能找到这么好的网站，得到高手指导，非常感谢！我明天就联系。

shanghainese

另外，最好别做双标，吃力不讨好，除非你是高手。

bananalcx

    我也正为双标发愁呢。半年前用博士德的双标试剂盒做过几次，用NBT显色显6－7h颜色很淡，与说明书显色时间相差甚远，因当时时间紧要赶快搞出点东西来，后来就没坚持再做，现在想起来也没信心。因课题要证明移行及分化的细胞是神经元还是胶质细胞，如不做双标，本课题进行下去意义不大，我明年要毕业，怎么办呢？
    用相邻两张片子做两种抗体看同一部位不同的表达情况不知可否？又如何分析呢？或做双标免疫荧光是否容易一些呢？还望上海的这位老师能给出点主意，我将感激不尽！如不嫌麻烦的话，可发至我的信箱：bananalcx@263.net  or  licx@gzsums.edu.cn

shanghainese

由于你用的是冰冻切片，可以做荧光免疫双标，选用反差大的荧光燃料。在同一部位拍照后，通过计算机将两张照片重新组合起来就可以了。

bananalcx

另外还有几个问题：
  我们做冰冻切片过程如下：经心脏灌注取脑，4％多聚甲醛（灌注液）固定1.5～2h,20~30%蔗糖（PBS配）沉底，开始切片。玻片晾干后铝箔纸包好，放－40℃保存待用。
1 取脑后固定时间：文献报道8、24h等都有，我们的时间是师兄、师姐传下的，究竟几小时更好？
2 蔗糖PBS配还是多聚甲醛配好？用多聚甲醛配的时前面固定时间可短一些？
3 切片中用玻片粘片后室温晾干最长不能超过多长时间？
4 切片厚度如做普通组化5～10微米即可吧！做荧光或LSCM是否必大于20微米？
5 做原位杂交时蔗糖要加DEPC后高压锅蒸，蒸完后发现颜色变黄，是否影响处理效果？能否先用DEPC处理PBS液，之后再用该液溶解蔗糖？另外，玻片要用粘片剂（APES）处理，而APES需用DEPC处理吗？
6 做组化用石蜡切片较冰冻出的结果漂亮，且石蜡切片影响因素少一些，是否在二者中应首选石蜡切片来做（抗体说明要求必用冰冻者除外）？
以上的问题可以说是我们神经科实验室免疫组化组部分同学都不能很肯定的问题，因我们不是搞病理专业的，只能边做边问，但问的结果却不一致。盼能得到回答，谢谢！

shanghainese

“另外还有几个问题” 回答如下：
“我们做冰冻切片过程如下：经心脏灌注取脑，4％多聚甲醛（灌注液）固定1.5～2h,20~30%蔗糖（PBS配）沉底，开始切片。玻片晾干后铝箔纸包好，放－40℃保存待用。”
1.取脑后固定时间：4度C 过夜，少于24小时。2.蔗糖用PBS和蒸馏水配。
3.您用的冰冻切片法是漂片法，不需用玻片粘片。
4.切片厚度，如做普通冰冻或石蜡切片组化5～10微米即可。但漂片法切片厚度为20至40微米。
5.原位杂交作得不多，无法帮你们的忙。
6.用不用石蜡切，根据抗体来决定。有些抗体只能用于冰冻切片，有些抗体只能用于石蜡切片，有些抗体两者都能用。
另外，尽量不要做双标。
希望以上回答能让你们满意。如有不当之处，请多多原谅。

bananalcx

首先能答复就很感谢了！
   我们做冰冻切片后都是用玻片粘片的，文献上看过漂片法，也听过该法做组化表达的几率要高，但目前还没见过如何做，容器用EP管即可/用枪头可捞片或有专用捞片工具？最后放置到载玻片上如何展开/能粘住或较长久保存吗？这些问题书上可能会找到吧？提出来见笑了。我们学校肯定有做的，应该能学会。
   另外，我用APES处理的玻片有一部分晾干后有白色小点状物，我怀疑是放入APES里面晃动几下之故，不知是否会影响染色及阅片？

emergency

引用:

下面引用由shanghainese在 2003/10/23 10:37pm 发表的内容：
您可换用 BD Biosciences 的 BrdU 免疫组化试剂盒。联系地址：
BD广州办事处
广州市东风中路410-412号
健力宝大厦1208室
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