白杨小小

请问冰冻切片免疫荧光染色中如果triton浓度过高或作用时间过长是否会导致背景过深,定位不准确,如应该是细胞核定位却出现细胞浆染色,10um的冰冻切片triton浓度和时间应该多少合适?;另外冰冻切片DAB显色一抗浓度1:100,效果不错,如果用免疫荧光标记该浓度是否合适?微波抗原修复方法是否适用于免疫荧光标记,会不会加深背景?急需指导,非常感谢!!

shanghainese

引用:

原帖由 白杨小小 于 2007-11-20 19:41 发表
请问冰冻切片免疫荧光染色中如果triton浓度过高或作用时间过长是否会导致背景过深,定位不准确,如应该是细胞核定位却出现细胞浆染色,10um的冰冻切片triton浓度和时间应该多少合适?;另外冰冻切片DAB显色一抗浓度1:1 ...

冰冻切片为什么要用triton？

白杨小小

我是做小鼠脑组织冰冻切片，多聚甲醛固定，一抗是在核内表达的转录因子，该抗体说明书要求用0.3%PBS/triton 稀释抗体，可是片子背景很深，胞浆染色而不是胞核染色，不知道什么原因，请赐教！

shanghainese

引用:

原帖由 白杨小小 于 2007-11-21 21:09 发表
我是做小鼠脑组织冰冻切片，多聚甲醛固定，一抗是在核内表达的转录因子，该抗体说明书要求用0.3%PBS/triton 稀释抗体，可是片子背景很深，胞浆染色而不是胞核染色，不知道什么原因，请赐教！

你的切片不厚(<=10u),没有必要用triton，一般的PBS就可以了。
另外你仔细看一下一抗说明书，能否用于甲醛固定的组织切[片。如果说能，那就要怀疑一抗的特异性是否有问题。 你说背景很深，那么isotype control 如何？

白杨小小

未加阴性对照的背景同样深，至于特异性我已经用ＤＡＢ显色证实是有效的，就是用免疫荧光标记不上，很奇怪不知道原因所在．

shanghainese

看来一抗有问题。你是从那里买的？

白杨小小

CST公司

shanghainese

最好去问Cell Signaling Technology.