starry

最近连续几天用手工做免疫组化，做的几批项目中总是有1-2个ki-67呈假阴性，之后加对照重新做，结果为阳性，可是总是出现第一次做不出来的情况，每次都有几张要重做，用机器做，ki-67每次都呈阳性，并且效果很好，实在找不到手工做不出的原因，求教！！！以下是我手工的步骤
1、烤片 80°C 1小时
2、水化 过两缸二甲苯 两缸100%酒精
3、柠檬酸修复  高压锅，水开后放片子，出气后计时3min ，停止，冷水降温。
4、冲洗
5、双氧水修复6min
6、冲洗
7、加一抗，一个半小时，37°C
8、冲洗
9、加二抗，半小时，37°C
10、冲洗
11、DAB显色
试剂盒，抗体，显色液用的福州迈新的，之前没出问题，就是最近做不出来了，求教！

jensen0901

迈新的Ki-67，试试EDTA9高压修复看看。

dingwei

修复后冷水降温，片子从多少度的缓冲液里拿出来洗？

starry

冷水是自来水，给高压锅降温，降到室温的，锅里的缓冲液大约20°C。

[ 本帖最后由 starry 于 2015-11-27 20:03 编辑 ]

starry

今天试了EDTA ph9 还是出现之前的结果，这次做了9个ki-67，有一个乳腺低分化癌的呈阴性，其他的多少都有阳性，还有一个泛染了。

zxjyongyan

我一直认为这是ki67不稳定造成的，国产试剂经常出现这种情况。我们医院最近ki67，er，pr也是这样，经常会出现1,2个阴性，重做后又阳。。。

dingwei

感觉不是，你还得找原因，如果试剂有问题，第二次不应该能做出来，你是隔水煮还是直接把缓冲液放高压锅内煮？

lijiahua

这种情况经常出现，手工做结果不稳定，说明在操作过程中出现失误，

ly97105

我们科里有两台免疫组化机，平时也做手工免疫组化，但是流程跟你的稍有区别，我们手工做出来的没出现过你这种情况。
1、烤片 70°C 1小时
2、三缸二甲苯 ，100%酒精，95%，90%，80%至水洗。
3、柠檬酸修复  高压锅，水开后放片子，出气后计时1分20秒 ，停止，冷水降温（中间换2-3次降温的凉水），一定要等柠檬酸修复液凉了才可以。
4、PBS冲洗5分钟两遍。
5、双氧水修复12min
6、PBS冲洗5分钟两遍
7、加一抗，一个小时（室温大于23度）
8、PBS冲洗5分钟两遍
9、加二抗，半小时
10、PBS冲洗5分钟两遍
11、DAB显色


这是我们的手工免疫组化的步骤，希望能帮到你。

小飞侠2010

每次都做阳性对照了？