返回首页 | 病理技术专题 | 病理资讯 | 病理图库 | 病理技术精英 | 同行交流 | 技术会诊 | 点滴经验 | 常规切片 | 特殊染色 | 分子免疫 | 细胞园地 | 电镜技术 | 收藏本站
发新话题
打印

求教

求教

各位老师,我做免疫组化有一年多了,但是总觉得效果不是很好,比如说淋巴结,总是黄成一片,看很多老师做的片子都是包膜清晰,可我做的总觉得浑得要死,我怀疑和修复过程有关,但是不知道该怎么办才好,希望高手指点迷津,希望大家帮忙分析下原因,并能多给些修复的方法,谢谢!

TOP

引用:
原帖由 永远 于 2010-7-28 10:00 发表
各位老师,我做免疫组化有一年多了,但是总觉得效果不是很好,比如说淋巴结,总是黄成一片,看很多老师做的片子都是包膜清晰,可我做的总觉得浑得要死,我怀疑和修复过程有关,但是不知道该怎么办才好,希望高手指点 ...
您这个问题是个大问题。是个范围很大的问题。
我认为要做好免疫组,首先组织切片要好。简单地说就是抗原保存得好,抗原的位置没有改变,抗原上的表位没有改变。
第二,抗体要好。这里说的是好抗体要有高特异性,高效价,高纯度。抗体的保存要好。没有过期, 没有变性。
第三,streptavidin-HRP 和底物要好,显色快,颜色强。
第四,要有好的protocol. 各项试剂都用在最佳浓度和使用量,孵育都在最佳时间里。

祝您好运!

TOP

谢谢shanghainese老师,免疫组化的每一步都很重要,都很关键,关于抗体保存的问题,怎么知道抗体是否变性?有时候加抗体时,不小心碰到组织,抗体是不是会受到污染?还有就是我们用的是即用型抗体,对于这种应该怎么办呢?因为我们只用了迈新的试剂,有想过更换克隆号,不过到目前还没有来得及尝试。显色液是现配现用,所用的都是迈新的试剂。

TOP

曾经有老师说我做的片子阳性信号很弱,甚至有假阴性,我加了对照片,并延长了一抗的孵育时间,由原来的37°一个小时增加到了37°一个半小时,阳性信号增强,但是对照片在我看来仍旧没有达到标准,我总怀疑是我修复过程有问题,我现在是水浴修复,电磁炉加热,水煮20分钟,然后放到保温档十分钟,自来水冲洗至室温,因为片子少,为了节省修复液,加热的锅内还放了个不锈钢的杯子,修复液是柠檬酸修复液,PH6.0,不知道老师我这样做有什么可以改进的没?或者老师现在使用的是什么样的修复方法,让学生学习一下,谢谢!

TOP

引用:
原帖由 永远 于 2010-7-29 11:31 发表
谢谢shanghainese老师,免疫组化的每一步都很重要,都很关键,关于抗体保存的问题,怎么知道抗体是否变性?有时候加抗体时,不小心碰到组织,抗体是不是会受到污染?还有就是我们用的是即用型抗体,对于这种应该怎么 ...
关于抗体保存与抗体的浓度很有关系.一般不少于50ug/ml。 有时加些carray protein 来增加浓度。防腐剂可用叠氮钠或proclin。抗体在-80度C 保存时间很久,但是一般不要反复融冻超过三次。
加抗体时,不小心碰到组织,抗体不一定受到污染。
即用型抗体的浓度很低。时间长了,温度过高都会影响抗体的使用寿命。

TOP

引用:
原帖由 永远 于 2010-7-29 11:43 发表
曾经有老师说我做的片子阳性信号很弱,甚至有假阴性,我加了对照片,并延长了一抗的孵育时间,由原来的37°一个小时增加到了37°一个半小时,阳性信号增强,但是对照片在我看来仍旧没有达到标准,我总怀疑是我修复过 ...
孵育建议在室温,也就是20 到25度。时间不要超过两小时。或者在4度C过夜。 孵育时间过长温度过高都会产生非特异染色。
每一个抗体,每一个克隆,都有自己的特点。它们与抗原反应的表位(epitope)都可能不一样。所要求的抗原修复条件也不相同。这就要求我们仔细看说明书,严格按说明书上的步骤去做。

TOP

谢谢shanghainese老师,我会继续努力!

TOP

要做好淋巴结免疫组化关键:
1、淋巴结取材时一定要将两面的被膜切掉,中性缓冲福尔马林固定,固定时间要够,使组织固定良好,切开被膜也利于脱水。淋巴结的取材、固定、脱水是免疫组化质量的最基础最重要的保证,固定、脱水没做好,再怎样改善免疫组化操作也是收效甚微的。
2、免疫组化使用的脱蜡剂、酒精要专用,别跟常规切片脱蜡合用,一定要定期更换液体保证脱蜡、脱二甲苯完全干净。
3、建议直接把修复液放进压力锅里高压修复,柠檬酸修复液不贵呀,犯不着为一天省两元钱影响免疫组化质量,做不好挨重做就更不划算啦!
4、免疫组化试剂要好,操作要规范(这些方面楼上的高手们都谈到了,我就不在这啰嗦啦!

个人意见,仅供参考!

[ 本帖最后由 王华 于 2010-8-4 13:44 编辑 ]

TOP

发新话题