细胞涂片染色分析
[这个贴子最后由yds在 2005/06/07 08:55pm 编辑]
学习细胞学时，对常规的技术环节曾作了大致总结，请指正：
染色不良原因分析
细胞涂片常规巴氏染色步骤及原理：
具体步骤：
1、涂片投入95%酒精固定液 固定15分钟。
目的：细胞及胞内物质形态稳定（由半液态变为半固态），易于染色。
原因：固态比液态（流动性）更具稳定性，着色更迅速，染色效果也更稳定。
2、水洗 用浓度由高到低的 梯度酒精 入水 或直接 自来水漂洗。
目的：脱醇—置换出细胞内酒精，以便使水溶性苏木素进入。
3、苏木（水溶液）染核 时间灵活掌握，根据镜下观察染色效果 确定。
4、水洗 洗去过多残留苏木染液，
5、碱水（饱和碳酸锂）返蓝
目的：使苏木色精进一步形成，且使胞浆偏碱性，以便更好的与酸性染料结合。
6、水洗去多余碱水。
7、脱水 用浓度由低到高的 梯度酒精 或直接由水进入95%酒精。
8、橘黄和EA（O—E染色）染胞浆
操作：每次染后 进入 95% 酒精漂净多余染液，以保证 不影响 下一步。
9、无水酒精脱水 —— 二甲苯透明 —— 树胶封固。
可能出现误差的步骤：
1、固定时间要求是：大于15 分钟，小于48小时。
如果制完片后马上进入水洗染色，固定效果必然欠佳。
2、水洗脱醇 应保证足够的时间和换水次数，
否则脱醇不彻底，会干扰水溶性苏木素进入细胞内进行染色反应。
3、苏木素的染色效果与本身的浓度、纯度，染色反应的速度直接相关。
此外，染色速度还受温度影响（温度越高，染色速度越快，效果越好）。
所以：本步骤注意事项为：
苏木素的质量——每日过滤并加新液；
天气温度（室温）的变化——调整时间，温高则时间短，温度低则时间长，皆以镜下观察的效果为准灵活掌握。
4、碱水返蓝：
为水溶液,其浓度和纯度都会影响返蓝效果。
如果碱水使用时间过长，未及时更换，其浓度、纯度必然下降。
为加快速度或工作时间调整，玻片放入碱水中的时间常常偏长或偏短。
偏短——苏木色精形成不充分；
偏长——涂片在水溶液中浸泡过久会影响细胞固定效果,从而影响染色效果。
以至于影响苏木素的显色效果和下一步胞浆染色效果。
5、橘黄和EA的染色效果，
由 染液质量（配方、浓度、纯度）和染色时间 决定。
且橘黄和EA一般都使用醇溶液，所以，此前的酒精漂洗脱水步骤也很重要。
此外，温度对效果的影响也和苏木素一样。
6、酒精的浓度、纯度受温度和使用率的影响。
气温上升，会使酒精挥发——浓度下降，导致以下效果
● 固定效果不佳，影响染色。
● 脱水不彻底，影响胞浆染色；
● 脱水不彻底，影响二甲苯透明。
7、透明
二甲苯透明不充分，镜下观察的效果就是结构模糊——不透明、不清亮的感觉。
比喻：透明良好的效果象是泡在清水中，清澈见底；
不透明 或透明效果不好 就象是泡在米汤或胶水中，（或是嵌在毛玻璃内），
感觉模模糊糊，看不清结构。
此外，还可用石蜡油做透明剂。
8、有些医院的巴氏染色效果很好，几年不褪色，而效果不好的最快三五个月就开始褪色。
我观察实验的结果是：EA染色有问题。褪色的涂片残留的颜色为红色，而且是苏木精被还原后呈现的红色，而EA中的伊红、淡绿颜色全无；所以，应该注意：
伊红、淡绿的染色效果——包括原液的质量和配制；如酸碱度的调整；还有就是操作。
9、所有的染液和洗液都应定时过滤、定时更换。
其中的很多原理至今我也没弄清楚，翻了一些书也是操作过程、结论明确，但原理未分析透彻，或许是因为自己水平太浅，期待出现一本简明扼要因果清晰的书。
