tequila

大家好，我们实验室现在做周围神经的半薄切片，但是组织皱缩以及片子褶皱的问题严重，各位有何好的经验，请分享！谢谢！
我们目前采用的是：
2.5%戊二醛固定3-5天，锇酸固定2小时
50%酒精15分钟--70%酒精15分钟--90%酒精15分钟--1：1液（95%酒精：95%丙酮）15分钟--95%丙酮15分钟--100%丙酮1（10分钟）--100%丙酮2（10分钟）--100%丙酮3（10分钟）
丙酮：Epon812树脂 1：1（1小时）--丙酮：Epon812树脂 1：4（1小时）--纯Epon812树脂（2小时）
聚合：35度（16小时）--45度（8小时）--55度（16小时）--60度（48小时）
请各位指点（关于固定的时间，脱水的步骤等） :em02:  

fzxd888

1、半薄切片的皱缩的解决办法，我们是这样做的：将半薄切片捞起后放在滴有蒸馏水的载玻片上，然后在酒精灯上烘烫，待半薄切片完全展开后，用吸管将水吸走，再将切片烘干即可。最后用1%甲苯胺蓝染色，光镜下观察，定位。
2、脱水我们目前还是用丙酮脱水，浓度为50%、70%、80%、90%、100%（两次，各10分钟），前面步骤各为15分钟。1：1（丙酮：环氧树脂）浸透2小时，1：4过夜（30度温箱）
3、聚合时间安排是：45度3小时，65度48小时
以上仅供参考

fzxd888

片子皱缩还有可能是包埋剂配方稍软，可以配置硬一点试试看，

tequila

非常感谢888！！
用火焰烘烤有利于片子展平是么？我回去试试看！不过，你说的蒸馏水是一滴很圆很圆的水珠么？我们也是用蒸馏水珠展片子，但是有的时候水珠不够鼓，成一滩，张力不够大，片子就展不平。还有，我们以前也用火焰烤干，片子上的细褶很多，影响观察，不知道是不是因为距离火焰太近温度过高加热不均匀。后来我们用60度烤箱烤干，慢一些，但似乎皱褶稍少一些，强点有限。不知道还有没有更好的办法。

tequila

还想请问一下，有没有经济实惠的粘片剂配置方法，可以让水珠在载玻片更鼓一些？

kinguard

fzxd888  说的很对，片子在水滴上可以展开，然后用酒精灯烘，效果很好
水滴散开，那是因为载波片不干净，用纸擦干净，应该就可以了。表面张力的作用下，水滴总是趋于保持最小体积。
酒精灯烘片就可以了，看到水开始蒸发的时候，就可以移开灯了

wcju

请教tequila和各位老师一个问题，要测量周围神经的髓鞘厚度和轴突直径，是用半薄切片在光学显微镜下测量吗？具体怎麽测量？有别的方法吗？谢谢！   　  

fzxd888

神经髓鞘厚度和轴索直径的测量可以直接用电镜测量，要取横切面，排除斜切面，而且要测量多个位置，并要采取随机测量法，不过，不同直径的神经纤维，其髓鞘的厚度也会不同。另外，也可以利用图象分析软件进行计算。

tequila

最近我们查阅了一些书，发现组织皱缩（呈茄子型）主要是因为所取神经过粗锇酸固定这一步组织渗透不好造成的，我们将组织去下来之后纵行分成两半，再进行固定，效果就好多了，都是圆的。^_^b

tequila

片子皱褶的问题，我们是用烤片机解决的。虽然花了7000，但是效果真得很不错，很少有摺，现在一个标本只要切几张片子就OK了。