永远

各位老师，我做免疫组化有一年多了，但是总觉得效果不是很好，比如说淋巴结，总是黄成一片，看很多老师做的片子都是包膜清晰，可我做的总觉得浑得要死，我怀疑和修复过程有关，但是不知道该怎么办才好，希望高手指点迷津，希望大家帮忙分析下原因，并能多给些修复的方法，谢谢！

shanghainese

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原帖由 永远 于 2010-7-28 10:00 发表
各位老师，我做免疫组化有一年多了，但是总觉得效果不是很好，比如说淋巴结，总是黄成一片，看很多老师做的片子都是包膜清晰，可我做的总觉得浑得要死，我怀疑和修复过程有关，但是不知道该怎么办才好，希望高手指点 ...

您这个问题是个大问题。是个范围很大的问题。
我认为要做好免疫组，首先组织切片要好。简单地说就是抗原保存得好，抗原的位置没有改变，抗原上的表位没有改变。
第二，抗体要好。这里说的是好抗体要有高特异性，高效价，高纯度。抗体的保存要好。没有过期， 没有变性。
第三，streptavidin-HRP 和底物要好，显色快，颜色强。
第四，要有好的protocol. 各项试剂都用在最佳浓度和使用量，孵育都在最佳时间里。

祝您好运！

永远

谢谢shanghainese老师，免疫组化的每一步都很重要，都很关键，关于抗体保存的问题，怎么知道抗体是否变性？有时候加抗体时，不小心碰到组织，抗体是不是会受到污染？还有就是我们用的是即用型抗体，对于这种应该怎么办呢？因为我们只用了迈新的试剂，有想过更换克隆号，不过到目前还没有来得及尝试。显色液是现配现用，所用的都是迈新的试剂。

永远

曾经有老师说我做的片子阳性信号很弱，甚至有假阴性，我加了对照片，并延长了一抗的孵育时间，由原来的37°一个小时增加到了37°一个半小时，阳性信号增强，但是对照片在我看来仍旧没有达到标准，我总怀疑是我修复过程有问题，我现在是水浴修复，电磁炉加热，水煮20分钟，然后放到保温档十分钟，自来水冲洗至室温，因为片子少，为了节省修复液，加热的锅内还放了个不锈钢的杯子，修复液是柠檬酸修复液，PH6.0，不知道老师我这样做有什么可以改进的没？或者老师现在使用的是什么样的修复方法，让学生学习一下，谢谢！

shanghainese

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原帖由 永远 于 2010-7-29 11:31 发表
谢谢shanghainese老师，免疫组化的每一步都很重要，都很关键，关于抗体保存的问题，怎么知道抗体是否变性？有时候加抗体时，不小心碰到组织，抗体是不是会受到污染？还有就是我们用的是即用型抗体，对于这种应该怎么 ...

关于抗体保存与抗体的浓度很有关系.一般不少于50ug/ml。 有时加些carray protein 来增加浓度。防腐剂可用叠氮钠或proclin。抗体在-80度C 保存时间很久，但是一般不要反复融冻超过三次。
加抗体时，不小心碰到组织，抗体不一定受到污染。
即用型抗体的浓度很低。时间长了，温度过高都会影响抗体的使用寿命。

shanghainese

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原帖由 永远 于 2010-7-29 11:43 发表
曾经有老师说我做的片子阳性信号很弱，甚至有假阴性，我加了对照片，并延长了一抗的孵育时间，由原来的37°一个小时增加到了37°一个半小时，阳性信号增强，但是对照片在我看来仍旧没有达到标准，我总怀疑是我修复过 ...

孵育建议在室温，也就是20 到25度。时间不要超过两小时。或者在4度C过夜。 孵育时间过长温度过高都会产生非特异染色。
每一个抗体，每一个克隆，都有自己的特点。它们与抗原反应的表位（epitope)都可能不一样。所要求的抗原修复条件也不相同。这就要求我们仔细看说明书，严格按说明书上的步骤去做。

永远

谢谢shanghainese老师，我会继续努力！

王华

要做好淋巴结免疫组化关键：
1、淋巴结取材时一定要将两面的被膜切掉，中性缓冲福尔马林固定，固定时间要够，使组织固定良好，切开被膜也利于脱水。淋巴结的取材、固定、脱水是免疫组化质量的最基础最重要的保证，固定、脱水没做好，再怎样改善免疫组化操作也是收效甚微的。
2、免疫组化使用的脱蜡剂、酒精要专用，别跟常规切片脱蜡合用，一定要定期更换液体保证脱蜡、脱二甲苯完全干净。
3、建议直接把修复液放进压力锅里高压修复，柠檬酸修复液不贵呀，犯不着为一天省两元钱影响免疫组化质量，做不好挨重做就更不划算啦！
4、免疫组化试剂要好，操作要规范（这些方面楼上的高手们都谈到了，我就不在这啰嗦啦！ ）

个人意见，仅供参考！

[ 本帖最后由 王华 于 2010-8-4 13:44 编辑 ]