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                      生物芯片在病理诊断中的应用
           纪小龙  尹彤  (解放军总医院病理科  北京  100853)
   
生物芯片技术作为电子学和生命科学结合产生的高科技杰作，虽然诞生仅仅几年的时间，却引起人们的广泛关注。本文对生物芯片技术在病理诊断中的潜在作用予以简介。
基本概念: 所谓“生物芯片”，是借鉴计算机平行分析的思想，对生物信号进行平行分析，利用微点阵技术将成千上万个生物信息密码集中到一小片固相基质上，从而使一些传统的生物学分析手段能够在尽量小的空间范围内，以尽量快的速度完成。
由于尚未形成主流技术，生物芯片的形式非常多，以基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以所检测的生物信号种类分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整的活细胞；按工作原理分，有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等。由于生物芯片概念是随着人类基因组的发展一起建立起来的，所以至今生物信号平行分析员成功的形式是以一种尼龙膜为基质的“cDNA阵列”，即DNA芯片，又称为基因芯片(gene　chips)。DNA芯片是指利用大规模集成电路的手段控制固相合成的成千上万个寡核昔酸探针，并把它们密集、规律地排列在1cm2大小的硅片或玻璃晶片(glass wafer)上，其容量可达20—40万个基因探针。然后将荧光标记的DNA或cDNA样品在芯片上与探针杂交，经激光共聚焦显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号作出比较和检测。该技术最大的潜在作用是可同时分析数千种基因的改变，即能够在同一时间内分析大量的基因，准确高效地破译遗传密码。这将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。
病理学中的初步应用
   现代医学的核心是揭示疾病的发生发展机理，其中基因或基因组水平上的分子病理学研究则是最新、最深层次的病理学。人类所有的疾病都直接或间接地与基因有关，DNA芯片在这个关键环节上能定量地给出欲测基因的信息，因此，致病基因或疾病相关基因的发现、定位、克隆和鉴定将是今后病理学中的焦点和“亮点”。
1、在基础研究中的应用
1．1  基因表达检测的研究  人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、酵母及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术(共157112个探针分子)一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。DNA芯片还被很多研究者用于回答不同的与基因表达有关的问题。Derisi等应用大约1000种cDNA的高密度芯片检测了实验性人类黑色素细胞系肿瘤抑制系统中基因表达的差异，结果发现在检测的900个基因中，有1．7％的基因在肿瘤表型被抑制的过程中发生下调，7％的基因出现上调。Welford等应用代表性差异显分析(RDA)结合基因芯片杂交技术检测了2种具有不同生物学行为的尤文肉瘤组织中基因表达的差异。该作者将BDA所得cDNA排列成高密度芯片，与不同荧光标记的两种来源起始扩增子杂交后，测量每一DNA位点上的荧光信号强度。荧光信号的相对量与RDA扩增子中的片段丰度及起始mRNA的丰度呈正相关。因此，RDA方法可提供差异表达基因的浓缩库，与DNA芯片结合后则可同时、快速、可重复地筛选上万种DNA分子，从而获得差异表达基因库。
1．2  基因生物学功能分析的研究  检测了基因表达之后，下一步是找到其生物学功能的差异。目前，通过基因破坏所产生的突变型酵母菌株可被用于鉴定由末确定基因编码蛋
白的生物学功能。突变菌的适合度可在各种选择性生长条件下进行监控，例如萦外线照射。此项工作耗时费力。RonDavis等最近所采用的方法是，通过加入一独特序列或标志而构建插入突变型酵母菌株。从特定环境中存活的菌株中扩增分子标志序列，与高密度芯片杂交，以确定菌株的相对丰度。此过程可在不同时项点重复进行，以精确的比较每一缺失菌株的适合度。这种应用芯片技术的方法就好象是检测某种突变型酵母的“分子条码”。
1．3  核酸突变的检测及基因组多态性分析  实践证明，基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性分析，例如对人BRCA I基因外显子11、CFTR基因、β—地中海贫血、酵母突变菌株间、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因(与Sanger测序结果G一致性达到98％)等的突变检测，对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16．6kb基因组多态性的研究等。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因(res等)的单碱基突变。
1．4  基因组文库制图的研究  有人曾通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图。DNA芯片用于基因组文库制图来确定邻接克隆的顺序，进一步强化了疾病易感性与发病机理之间的联系。“后裔相同(identical by descent，IBD)”的基因组DNA片段，是具有共同祖先的人所共有的遗传标志。遗传学家发现，患者中IBD区域中可能潜藏着易感基因。因此，IBD可作为定位克隆的标志。IBD片段的大小取决于共同祖先和某个体之间的世代数目，也决定了需要进行筛查的遗传多态性标志的数目。Cheung等应用DNA芯片技术以及基因组错配筛查(genomic mismatch screening，GMS)技术，证实了先天性高胰岛素血症基因的位点，不再需要应用大肠杆菌错配修复蛋白去除两个基因组之间包含错配的DNA，而一次一个地筛查多态性标志，因此可使IBD片段富集。
1．5  杂交测序  是基因芯片技术的另一重要应用。该测序技术理论上不失为一种高效可行的测序方法，但需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探针。基因芯片技术可以比较容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的问世无疑为杂交测序提供了实施的可能性，这已为实践所证实。
2  在病理诊断中的应用
2．1  在肿瘤诊断中的应用  传统的肿瘤病理分类是建立在形态学的基础上，这种基于表型上的分类仍被广泛应用，但却存在着很大的缺陷，例如，同一类型的肿瘤可能会出现临
床表现上的差异，对治疗敏感性的不同，以及预后上的迥异。因此有必要发现一种全新的肿瘤分类方法，以实现对临床更有价值的指导。一些研究对于基因芯片在临床病理基因分
类中的潜在用途给予了高度评价。尽管在过去的30多年间，癌的分类已经取得了巨大进步，但目前仍没有一种共同的方法来进行新的癌分类(“发现性分类”Class discovery)或者将某个肿瘤划分到已知的分类中去(“预测性分类”ClassPrediction)。现在有一种建立在基因表达基础上的肿瘤分类方法，其基因的表达由DNA芯片(DNA microarrays)监控，这种方法首先由Golub此等人试验性地应用于人类急性白血病。他们证明通过发现性分类步骤，能够自动地发现急性髓性白血病(acute myeloid leukemia AML)和急性淋巴母细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia)之间的区别，通过自动化的预测性分类能够确定新白血病的分类。结果表明，单纯依赖基因表达监控基础上的癌分类是可行的，而且可以在不依赖先前的生物学知识的前提下对其他类型的癌进行共同策略下的发现性和预测性癌分类。
   以后，Alizadeh等采用类似的方法对一组弥漫性大细胞淋巴瘤的基因表达进行了系统的观察，结果发现该组中有两种截然不同的基因表达方式，分别代表B细胞分化的不同阶段，因此进一步证实了以基因表达为基础的肿瘤分类可以识别出先前未被发现的而在临床上又具有重要意义的新的亚型。
   芯片技术除了可用于肿瘤分类，还可用于监测肿瘤相关基因的表达。目前人们已经发现了许多肿瘤相关基因，利用洲A芯片技术监测这些已查明的相关的基因群，对于深入研
究肿瘤的诊断和治疗具有重大的意义。另外，芯片技术的应用还有利于新的肿瘤基因的发现，这就为肿瘤的分子生物学研究提供了更广阔的前景。Wang等人利用DNA芯片(含有5766个cDNA探针)技术研究了人类的正常卵巢和卵巢癌中基因表达的差异，结果发现了一些新的与卵巢癌的生物学密切相关的基因。Rhee等人利用cDNA芯片(含588个基因)展现了3例胶质瘤中基因表达的高度异质性。在肾细胞癌的研究中，Moch发现将肿瘤细胞芯片与基因芯片结合的方法能够快速的识别并进一步评价基因在肿瘤生物学中的作用，从而将这种肿瘤基因标记物用于诊断和判断预后，并可成为以后治疗的靶目标。
   此外，现已报道了DNA芯片用于检测遗传性乳腺和卵巢癌基因BRCAI的点突变、插入及缺失等，以及筛查囊性纤维变性基因CFRT和β-珠蛋白基因的突变。一些生物技术公司开发了此技术。如Affymetrix公司很快地将两种芯片推向市场，一种是HIV-1蛋白酶和逆转录酶基因芯片，另一种是p53反密码子芯片。p53芯片包含了400多种与肿瘤相关的突变，用于确定具有发生肿瘤风险的个体。
   以后希望能够开发一种可以进行肿瘤早期诊断的生物芯片，让病人能够以一种心理上能适应的方式进行早期肿瘤诊断。而目前员重要的一个目标，是开发出一种廉价的诊断用的生物芯片，能够在数十分钟内完成多种人类肿瘤的普查，使大规模的肿瘤普查成为现实。
2．2  在遗传病诊断中的应用  芯片技术除了可用于肿瘤的病理诊断，还可用于遗传病的诊断。我们知道，染色体上的。显性基因能够表达性状，而一个隐性基因并不表现，只有2个隐性等位基因在一起时才会露出真面目。有许多遗传病的基因属于隐性基因，多数人只是携带者而不发病。现在有了芯片技术，通过分析各种遗传病的基因序列，制成基因芯片，可以很方便地找出隐性致病基因的携带者，从而避免两个携带者结婚生子。
从癌症的病因到确定息者体内潜伏的HIV的遗传变异，基因芯片不仅将用于许多创新性的研究，还将代替传统的体格检查和疾病诊断办法，尽早预知疾病。
其他芯片的应用
   除了DNA芯片外，其他应用较多的芯片还有组织芯片、细胞芯片、蛋白质芯片等。它们的原理与DNA芯片类似，只不过检测的生物信号不同。这里我们主要简单介绍组织芯
片。组织芯片又称组织微阵列(tissue microanty)，1998年由Kononen等在cDNA微阵列的基础上发明。其原理是将少量组织高密度地固定于固相载体上，然后用不同的基因、寡核苷酸、抗体与之进行杂交，以研究目的基因在不同组织之间的差异表达。组织微阵列的应用范围很广，可用于基因表达检测、验证新基因的特异表达、突变体与多态性的检测、药物筛选及疾病诊断等方面。在肿瘤研究中的应用也有较大的潜力和价值，对肿瘤的易感因素判定、早期诊断、及时治疗和预后推测起重要作用。
   随着生物芯片技术的不断应用，组织病理学家的作用将面临着转变，即在肿瘤基因分型的时候不再把重点放在组织学改变上。分子病理学家应该全面评价包括遗传风险和肿瘤表型在内的各种因素，为临床医生确定治疗策略提供更多资料。有人预言，生物芯片将为整个生命期中疾病预防提供永久性“线路图”。该技术的应用前景看好，在分子病理学，特别是肿瘤发生发展机理研究等方面的应用均有待于进一步开发。
生物态片的优缺点
   优点：生物芯片技术由于同时特大量探针固定于支持物上，所以可一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southem Blotting和Northem Blotting
等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值。
   缺点：尽管生物芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如成本昂贵，探针的合成与固定复杂，尤其是制作高密度的探针阵
列更是如此。在信号的获取与分析上，当前多数使用荧光法进行检测和分析，重复性较好，但灵敏度不高。另外对如此大量的数据信息进行读取与分析也是一个艰巨的技术问题。
随着科学技术的进步，生物芯片技术在未来的几年内其空间分辨率将由微米级向亚微米及纳米级发展，相应的检测技术也将由共聚焦荧光显微术向包括扫描近场光学显微术(SNOM)和原子力显微术(AFM)在内的纳米显微术发展。
摘自：诊断病理学杂志 2001年4月第8卷第2 期 110-112页