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         从组织切片上分离单个细胞的相关技术及其应用前景
      杨文涛  许良中  (上海医科大学肿瘤医院病理科  上海200032)
  
1、 从组织切片上分离单细胞方法的建立
   从组织切片上进行单个细胞分离，并扩增出靶DNA片段的技术是1993年由德国科隆大学的Hansmann等建立起来的一项新技术，并将其称为分子组织学技术。该方法的最
大优点在于能够针对所需研究的细胞，将组织形态和分子生物学技术密切结合，特别适用于细胞组成复杂的病变。同年，Trumper等用霍奇金病(HD)淋巴结制备细胞悬液，结合免疫组织化学，用微操纵器从细胞悬液中提取单个（RS)细胞，并成功地进行了聚合酶链反应(PCR)。两种方法相比较，前者更具优势，因为从组织切片上提取单个细胞，能密切结合形态学特征，更为直观和准确，同时也能将目的细胞与周围微环境中的背景细胞作相关性研究。获得单个细胞还有其他方法，如流式细胞仪、密度梯度离心、高梯度磁性细胞筛选，但细胞体积较大时，这些方法易导致细胞碎裂，而从组织切片上提取单个细胞不存在类似问题。
2、从组织切片上分离单个细胞的方法
   提取单个细胞所需组织最好是冻存的新鲜标本，采集时间越近越好。该方法是在已进行常规HE染色或免疫组织化学染色的冷冻切片上，通过光学显微镜寻找所需要的细胞，并借助显微操纵器，用分离微吸管(直径1—2微米)仔细分离所需细胞使其游离，通过液压传动(如Narishige 1M-5B)装置，可将单个细胞通过微吸管(直径10-20微米)转移人Eppendorf6管内。此后，可从分离到的单个细胞中提取DNA，进行PCR和IMJ测序。
3、 单细胞选的难点及注意事项
尽管单细胞提取及PCR技术有许多优越性，但在操作上有较大难度，对实验室的要求颇高，工作量非常大，因此目前只有少数单位能够开展。首先由于研究对象是单个细胞，因而要严格防止污染。因此除实验器具要严格消毒，以及设置备种对照排除干扰外，操作者自身也应注意不能携带可能造成污染的物品进入单细胞操作室。一般对单细胞PCR应采取重复实验以及双盲法。我们采取以下具体措施：⑦在进入单细胞操作室前必须沐浴，然后在准备室内换上专用制服和工作鞋，并带上手套。尤其要注意的是其他实验室的物品一律不得带入单细胞室；②枪头、移液器、试剂等所有实验物品必须为单细胞室专用；⑦单细胞提取时所需要的微吸管必须经高温消毒，每挑选一个细胞更换一次微吸管;④免疫组化也必须在专用实验室内进行，要求与进入单细胞室相同； ⑤PCR反应前各种试剂的配制、加模板、PCR反应、电泳检测PCR产物要分别在不同房间进行；⑥经常更换手套(尤其是在接触DNA模板和PCR产物后)，采用防止气溶胶的一次性吸管头等；⑦设立缓冲液对照，即只吸取覆盖在切片上的缓冲液，而不吸取细胞成分，在这种情况下，PCR扩增也应该全为阴性，若出现阳性条带，证明覆盖在切片上的缓冲液内有细胞污染。
单细胞提取的难度还在于其需要非常高的准确性，这取决于仪器设备的精度和操作者的水平。我们采用的是Nar-ishige的微操纵器和微吸管，配合Olympus显微镜和索尼公司的荧屏监视器。这套设备虽然比较先进，但在操作过程中也需要非常仔细，因为只要带有邻近细胞的任何一点细胞核成分，就失去了单细胞的真正意义。因此在操作过程中要从内侧缘分离细胞，从而最大限度地避免邻近细胞的污染。最近，激光微操纵器的出现有望使单细胞挑选的准确性进一步提高。
单细胞提取后，往往还需进行PCR反应和DNA测序。就对模板的量和纯度提出了较高的要求。与常规利用全组织DNA提取进行PcR相比，单细胞DNA的纯度明显增高，但量相应减少，导致单细胞PCR的扩增效率低于全组织PCR，增大了工作量。
4、 单细胞PCR的扩增效率
   单细胞PCR的扩增效率较全组织PCB低，其原因有如下几点：①5—10微米的冷冻切片使单个细胞的细胞核发生部分丢失，细胞越大丢失成分越多，其弥补措施为增加冷冻切片的厚度，尽可能保证细胞核的完整性。但在实际操作中，我们未采取这项措施，因为增加冷冻切片厚度的同时，一方面造成形态学观察的模糊，另一方面可能会造成细胞重叠，从而无法作到真正的“单细胞“，因此我们仍采用了5-10微米的冷冻切片。②单细胞操作不允许用苯酚、氯仿进行抽提，因为这会使本来已很微量的DNA丢失。我们采用蛋白酶K消化，尔后再灭活蛋白酶K的方法，但是这种纯化方法不能保证每个细胞的DNA都达到PCR扩增的要求。③在吸取细胞时微吸管管尖因毛细吸附作用会引起缓冲液内流，若控制不好，内流增多，导致整个体系中缓冲液浓度改变，同样会得不到阳性结果。④切片、免疫组织化学、单细胞提取的过程需要较长的时间且步骤复杂，可能会使细胞DNA受到损伤。上述诸点造成单细胞扩增的效率一般员高仅为50％左右。Kiippers报道淋巴结中套细胞扩增效率较高，达55％，而中心母细胞的扩增效率仅题％左右。这主要和细胞大小有关，套区B细胞体积较小，容易获得完整的细胞核，而中心母细胞体积较大，在一定厚度的切片上常常丢失部分细胞核。
5、  单细胞及其相关分子生物学技术的应用前景
目前该方法主要被运用于淋巴结造血系统疾病的研究，如霍奇金病中RS细胞的起源研究。由于HD侵犯的淋巴结中，肿瘤性成分RS细胞常少于1％，因而从组织中抽提的DNA实际上是肿瘤细胞DNA和其他细胞DNA的混合物，故这种抽提方法在检测RS细胞上是不适用的；用Southem杂交的方法也达不到肿瘤性成分必须大于1％—2％的基本要求。免疫组化和原位杂交相结合，可以对单个霍奇金细胞和RS细胞进行基因表达的检测，但不能对其DNA进行更详细的研究。单个细胞提取及PCR技术弥补了上述不足。Kuppers在1例结节硬化型霍奇金病(NSHD)中，从30个HRS细胞中获得了12个IgH基因重排产物，对其中8个产物进行的测序分析显示，7个细胞具有完全一致的序列，提示这1例NSHD圆中的RS细胞至少有一部分来源于克隆性B细胞。
由于从组织切片上进行单细胞分离、单细胞PCR及DNA调序有较大的难度，因此目前国际上开展该项技术的单位较少。而且由于单细胞研究的工作量相当大，所以目前发表的有关文章例数较少。尽管如此，它的优点仍是全组织PCR所无法替代的。在组织切片上进行单个细胞分离及PCR，就方法学而言完全具有可行性，对淋巴造血系统病变的研究也是非常适宜的。单细胞研究还可被运用于淋巴结生发中心及其他类型恶性淋巴瘤的研究，因为只有通过单细胞研究，才能获得有关克隆相关性、克隆内差异(interclonaldiversity)和延续突变(ongoing　mutation)的信息。该方法加以改进还可用于其他各种肿瘤，尤其可用于肿瘤细胞之间混有大量非肿瘤细胞者进行癌基因和抑癌基因的分析，以及肿瘤细胞的克隆性研究。
摘自：诊断病理学杂志 2001年4月第8卷第2 期 124-125页