免疫组化常用抗体的应用体会
对外科病理学来说，利用免疫组织化学方法鉴别各种细胞和组织已成为病理诊断的常规技术，这一方法的应用使得对肿瘤的诊断及分类更加准确。由于能够得到针对许多细胞标记物的高度特异的单克隆抗体以及由于最近在技术上的进步，简化了其在福尔马林固定常规处理的组织标本中的应用步骤，免疫组化在病理诊断中的应用正在不断深入。但随之而来的是如何准确分析免疫组化阳性及阴性结果的意义，使之真正发挥出诊断价值。现将我们工作中的几点体会归纳如下。
1 角蛋白(keratins)
角蛋白是上皮细胞的主要细胞骨架成分。这些中间丝经常被当作张力丝通过桥粒固定在一起。桥粒将相邻上皮细胞的角蛋白IFs连接起来，这样就使得上皮具有伸展性。通过利用双向凝胶电泳，已在人体鉴定出30种人类角蛋白，其分子量从40-68KDa，等电点从5.2-7.8不等，其中8种与皮肤附属器有关，例如头发和指甲。根据角蛋白的分子量以及所属性能被分为酸性角蛋白(Ⅰ型)和中性-碱性角蛋白(Ⅱ型)，8个Ⅱ型角蛋白(1-8)和12个Ⅰ型角蛋白(9-20)已在人体组织中鉴别出来。角蛋白总是成对地表达一个碱性和一个酸性角蛋白多肽分子，形成完整的超α-螺旋复合体，从而装配成中间丝的原丝，一个上皮细胞至少包含一个角蛋白对。
现有的依据表明角蛋白多肽的表达与分化密切相关，所以鉴定出特异的角蛋白组合方式后能够在独立于形态学特征的情况下，区别腺体和鳞状上皮的分化。这种依赖于分化的表达方式可将角蛋白多肽分为两组亚型：角蛋白Ⅱ型中的7和8与Ⅰ型的18和19是简单的单层上皮的典型特征，例如肝细胞、小肠和大肠的腺上皮。角蛋白Ⅱ型中的1-6与Ⅰ型中的9-17是复层鳞状上皮的特征，但不具有专一性。尽管角蛋白是上皮细胞和癌的典型细胞骨架中间丝，但Western印迹法所支持的免疫组织化学依据表明一些非上皮的正常细胞和肿瘤细胞也能表达角蛋白，主要是角蛋白8和18。众所周知，角蛋白表达常常见于上皮样肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤和脊索瘤中。尽管少见，但仍在许多其它肉瘤中发现角蛋白的表达，这些肉瘤包括平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，还有血管肉瘤。
2 波形蛋白：(Vimentin)
波形蛋白(分子量为57KDa)实际上见于所有的间叶细胞和间叶组织来源的肿瘤中。尽管早期的研究表明对这种中间丝的免疫染色可以帮助区别肉瘤和癌，但后来的研究表明波形蛋白并非间叶组织的特异性标记物，因为在一些正常的上皮细胞中以及黑色素瘤，淋巴瘤，这有多种癌，尤其那些起源于甲状腺，肾，子宫内膜，卵巢的癌中都可以出现波形蛋白的表达。梭形细胞癌经常出现波形蛋白的表达，可伴或不伴有角蛋白的出现。由于波形蛋白可出现于黑色素瘤、淋巴瘤、还有一些癌中，尤其那些伴有肉瘤样形态者，所以波形蛋白的诊断价值受到限制，尤其将其作为单一的标记物而不是作为一系列抗体中的一部分对疑难病例进行诊断、评估时，波形蛋白的诊断价值更受限。
3 结蛋白：(Desmin)
结蛋白(分子量为53KDa)是发现于平滑肌、心肌、骨骼肌细胞中的一种中间丝蛋白。免疫电镜研究已显示结蛋白与横纹肌细胞的肌小节的Z盘以及肌纤维膜的附着点(斑)紧密相关。在平滑肌细胞中，结蛋白使肌动蛋白束内的梭形密体与质膜内面的密斑相互连接。结蛋白出现于横纹肌细胞发生过程中的肌管形成期，成肌细胞在这一期相互融合。结蛋白丝最初呈纵向排列，但是随着肌细胞的成熟，它们便集中于Z盘周围。由于结蛋白丝与Z盘和膜斑紧密相连，通过电镜难以辨认。由于结蛋白的广泛分布并且其分布几乎只局限于肌细胞内，结蛋白被证实为肌原性分化的一个很好的标记物。
除了肌细胞和肌组织来源的肿瘤，结蛋白反应还被报告出现于一些非肌性细胞中，例如：人类淋巴结的网状细胞，非肌性恶性肿瘤例如恶性许旺氏细胞瘤、间皮瘤、上皮样肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、纤维样纤维瘤病、神经母细胞瘤、促结缔组织生成的小圆细胞瘤(促纤维生成性小圆细胞瘤)。
4 胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)
GFAP(分子量为51KDa)发现于星形细胞、室管膜细胞、以及非成熟的少突胶质细胞中。GFAP除了存于于神经胶质肿瘤中，还被证实存在于一些许旺氏细胞瘤中以及神经纤维瘤中，还存在于唾液腺和乳腺的正常细胞中及其来源肿瘤的肌上皮细胞中。
5 神经丝(Neurofilaments)
神经丝是高度磷酸化的蛋白三联体，由三个不同的亚单位组成：NF-L、NF-M、NF-H，各自的分子量为68KDa、150KDa、200KDa，神经丝主要存在于中枢和周围神经系统内的成熟神经元的轴突中，并被认为是轴管直径的决定因素。免疫组织化学研究表明神经丝存在于与神经有关的肿瘤中，例如：神经节瘤、神经节母细胞瘤、神经母细胞瘤、感觉神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、以及松果体瘤。神经丝反应还存在于Merkel细胞癌、胰岛细胞肿瘤、类癌以及肺小细胞癌中。除此之外，据报道，神经丝阳性的细胞偶尔还会见于尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、以及上皮样肉瘤中。需着重强调的是固定方式及时间会大大影响这些抗原的免疫反应。
6 多形上皮粘蛋白(上皮膜抗原, EMA)
在最近几年内，人们对研究肿瘤相关粘蛋白的组织分布及其作为细胞标记物在外科病理学中的潜在作用产生了浓厚的兴趣。在这些粘蛋白中，人们把注意力主要集中在被称为多形上皮粘蛋白的物质中。多形上皮粘蛋白被称作人类粘蛋白家族，大部分由哺乳期乳腺和其它腺上皮产生。单核心蛋白基因是它们的特征，呈现串联重复。Ormerod等把这种成分称为上皮膜抗原(EMA)。利用乳脂小体或人癌制剂，已生产出大量抗多形上皮粘蛋白的单克隆抗体。最常用于外科病理学的EMA单抗为E29，HMFG-1和HMFG-2，这些单抗都可以商购。免疫组织化学研究表明除了上皮肿瘤，EMA还表达在其它肿瘤中，尤其是间皮瘤、脑膜瘤、上皮肉瘤、滑膜肉瘤以及一些淋巴瘤中(Ki-1淋巴瘤)。已证实一部分周围神经肿瘤与其它神经周围鞘瘤(神经纤维瘤和许旺氏细胞瘤)相反，出现EMA的表达而不是S-100的表达。据认为这些来源于周围神经细胞的肿瘤(被称作周围神经瘤)缺乏对S-100的反应而与EMA发生强反应。其它软组织肿瘤也出现EMA反应，尤其是平滑肌瘤和恶性周围神经鞘瘤。
7 癌胚抗原(CEA)
CEA首先是一种上皮标记物，经常发现于结肠、胃、肺、子宫内膜和卵巢腺癌中，以及甲状腺髓样癌、移行细胞癌中。在上皮样肉瘤和滑膜肉瘤中也可发现CEA，但这种情况相当少见并且局限于分好较化的肿瘤中。以笔者经验认为，CEA在软组织肉瘤中的诊断价值是局限的，尤其与其它上皮标记物如角蛋白相比时。
8 肌动蛋白(Actins)
肌动蛋白是所有真核细胞微丝细胞骨架的主要成分。根据氨基酸序列的不同以及电泳迁移率的不同，现已鉴别出肌动蛋白的六种主要的同工型。在这些同工型中，骨骼肌α-，平滑肌α-，心肌α-，平滑肌γ-肌动蛋白只表达于肌细胞内。在最近几年内，一些针对肌动蛋白(肌肉内的)单抗已经生产并且可以商业购买 。在这些单抗中，HHF35和1A4被证实是最有用的，这两种单抗都可以买到而且非常适用于福尔马林固定，石蜡包埋的组织标本。
HHF35与肌动蛋白同工型的反应只出现于横纹肌、骨骼肌、心肌和平滑肌细胞中，而1A24只识别α平滑肌肌动蛋白，不与心肌或骨骼肌反应。除了正常的肌细胞外，两种抗体都与周细胞、肌纤维母细胞和肌上皮细胞反应。
9 肌球蛋白(Myosin)
肌球蛋白是球状能量转换酶，既充当ATP酶又作为纤维结构蛋白存在于肌细胞和非肌细胞中，如血小板、纤维母细胞、 粒细胞、子宫内膜细胞。肌球蛋白能够与肌动蛋白发生可逆的结合从而增强ATP酶的活性，这一内部反应就构成了肌肉收缩和一些非肌细胞运动的基础。所有肌球蛋白的分子量都在460-500KDa之间，它们的六面体结构是由两条相同的重链(分子量为200KDa)和两对不同类型的轻链(分子量大约为22KDa)构成的。肌肉中的肌球蛋白通过免疫学方法可分为平滑肌型和横纹肌型，骨骼肌和心肌中的肌球蛋白被称作sarcomeric肌球蛋白。由于多种不同的轻重链同工型的存在，这些蛋白组成了一个多相的蛋白群体。用于区别平滑肌肌球蛋白和sarcomeric肌球蛋白的抗体可用于诊断平滑肌或骨骼肌来源的肿瘤。
10 S-100蛋白
S-100蛋白最初是从牛脑组织中分离出来的，其特征及命名源于S-100可溶于100%的硫酸铵中。S-100代表一组小的Ca2+-，结合调节蛋白，参与细胞周期的进行、细胞分化、细胞骨架膜的相互作用。至今为止，已有大约17种不同的蛋白纳入S-100蛋白家族。S-100蛋白发现于神经系统的胶质细胞，Schwann细胞和卫星细胞中，以及软骨细胞、脂肪细胞和组织细胞的一些亚型中。S-100表达于正常的黑色素细胞中以及几乎所有良性、恶性增生的黑色素细胞中。S-100是历史上第一个用于诊断黑色素瘤的组织标记物。它已被用来诊断胶质瘤、schwann细胞瘤、脂肪肉瘤、组织细胞增生症X、软骨细胞来源的肿瘤以及脊索瘤。在其它肿瘤包括一些癌、滑膜肉瘤、平滑肌肉瘤以及横纹肌肉瘤也可出现S-100的表达。由于S-100分布广泛，所以在诊断低分化肿瘤时不应把它作为唯一的标记物，而把它作为包括其它如上皮、造血、间叶组织表型的标记物组合的一部分用于免疫组化诊断中。
11 HMB-45
在过去的十年间，已有多种针对黑色素细胞系特异抗原的单抗，且能够应用于福尔马林固定，石蜡包埋的标本。这些单抗中，HMB-45是外科病理学家最常用的单抗。这种单抗是由包含色素的黑色素瘤细胞Mel-1产生的，这种细胞来源于黑色素瘤转移的淋巴结。HMB-45识别存在于前黑色素小体小泡中的10-KDa抗原。HMB-45与正常的黑色素细胞或皮内痣不反应，但可与交界痣或复合痣中的交界痣成分反应。大约90%的原发或转移的黑色素瘤与这一标记物反应阳性。除了促纤维生成性黑色素瘤，所有其它类型的黑色素瘤都与这种抗体反应。在对25例促纤维生成性黑色素瘤的研究表明，22%出现HMB-45反应性。软组织黑色素瘤(透明细胞肉瘤)几乎总是出现HMB-45阳性。除了黑色素瘤，黑色素神经外胚叶肿瘤，血管肌脂瘤，淋巴管肌瘤病，肺透明细胞肿瘤也出现HMB-45的表达，这与超微结构下前黑色素小体的存在有关。
12 KP1(CD68)
KP1单抗针对于肺巨噬细胞，属于CD68抗体群与110-KDa溶酶体糖蛋白反应。与大多数其它的CD68抗体不同，KP1可用于福尔马林固定，常规处理的组织标本。它可与正常的组织细胞发生强反应，并有报道表明KP1可以鉴别多种骨髓单核细胞肿瘤和真正的组织细胞淋巴瘤。1992年，Binder等人报道了CD68在MFH中的反应性，重新提出了MFH可能起源于组织细胞的这一问题。他们提示KP1免疫染色对诊断MFH有帮助。但是以后的研究表明KP1的反应存在于一系列其他肿瘤中，包括癌、黑色素瘤、软组织肿瘤例如平滑肌瘤、滑膜肉瘤和颗粒细胞瘤。现有的依据表明CD68不是组织细胞系的特异性标记物，KP1的免疫染色对诊断MFH无实际价值。
13 α-1-抗胰蛋白酶和α-1-抗糜蛋白酶(α-1 AT和α-1 ACT)
尽管早期的研究表明α-1 AT和α-1 ACT可作为诊断疑为组织细胞来源的肿瘤和恶纤组(MFH)的特异性标记物，但后来的免疫组化研究发现对这两种标记物的反应除了存在于MFH(横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤)外还存在于肺癌、胃癌、肝癌、胰岛细胞肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤和软组织肉瘤中。由于α-1 AT和α-1 ACT的特异性差，人们认为它们在软组织肉瘤的诊断中无实际意义。
14 第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ：RAg)
第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ： RAg)亦称为 von Willebrand's因子是凝血系统第Ⅷ因子复合体的一部分，并且是一种大分子(分子量为1000KDa)。因为FⅧ：RAg限于内皮细胞、巨核细胞、血小板，所以针对这一标记物的抗体已广泛应用于内皮细胞来源的肿瘤中。除FⅧ：RAg对内皮细胞的高度特异外，关于FⅧ，RAg对这类细胞敏感性的不同也有报道。例如：肾小球上皮细胞不与FⅧ：RAg反应，大脉管内皮细胞、肝、脾血窦内皮细胞反应微弱。同样，并非所有的血管肉瘤都与FⅧ：RAg反应，尤其是低分化血管瘤。
15 荆豆凝集素Ⅰ(UEA I)
UEA I是一种用于检测O型血相关H抗原的凝血素。无论病人是何种血型，UEA I都是一种对内皮细胞极为敏感的标记物。与FⅧ：RAg在血管肉瘤中的反应呈灶状倾向相反，这种凝血素结合反应对内皮细胞极为敏感，并且无论分化程度高低，都能出现在肿瘤细胞中。遗憾的是一些癌也表现出对UEA I的亲和性，这表明这种凝血素并不具备FⅧ：RAg对内皮细胞同样的特异性。
16 CD31
CD31是对属于免疫球蛋白超基因家族成员的130-KDa糖蛋白(gpⅡa)的集合命名，表达于一些生血细胞和内皮细胞中。CD31与出现在血小板和粒细胞表面的粘附分子PECAM-1(血小板内皮细胞粘附分子)相同。CD31与淋巴细胞跨内皮迁移有关。CD31在软组织肿瘤表达的唯一较大的研究中，De Young等人发现CD31在所有的12例血管肉瘤和10例血管瘤中表达，但在170例其它间叶肿瘤中无一例表达。在接下去的研究中，Miettinen等人报道CD31在27例血管肉瘤中的表达率为78%，Mentzel等人更近一些的研究发现，在24例上皮样血管内皮瘤中，CD31表达阳性者为19例，占79%。CD31在Kaposis肉瘤中的血管内皮细胞以及梭形细胞中的表达一致都为阳性。尽管CD31对内皮细胞分化具有毫无疑问的高度特异性，但由于已有报道表明有些少见的癌和间皮瘤也可出现CD31的微弱表达，因此在这方面还应加以注意。以笔者的经验认为，CD31是一种比FⅧ：RAg对血管肉瘤更敏感的标记物。
17 神经元特异性烯醇化酶(NSE)
NSE最早发现于脑组织，后来报道在正常神经内分泌细胞及其来源肿瘤包括神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤以及多种神经内分泌癌中都有NSE出现。尽管最初认为NSE是神经元特有的，但后来的研究表明在多种正常的非内分泌细胞(平滑肌细胞、血小板、淋巴细胞、Henle's袢的上皮细胞)、非内分泌肿瘤细胞， 包括肾癌、乳腺癌、卵巢癌、精原细胞瘤、脊索瘤、一些肉瘤(平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、腺泡状软组织肉瘤)以及淋巴瘤中都出现这一标记物的反应。目前，NSE在常规诊断中的意义不大，其它标记物如嗜铬粒蛋白、突触小泡蛋白在检测神经元分化的敏感性和特异性上都大大超过了NSE。
18 嗜铬粒蛋白(Chromogranin)
嗜铬粒蛋白是一组嗜酸性、水溶性的钙结合蛋白，出现在内分泌细胞的分泌颗粒中。主要的嗜铬粒蛋白包括A.B(也称作分泌粒蛋白Ⅰ)和C(也称作分泌粒蛋白Ⅱ)嗜铬粒蛋白A是上述三者中最普遍存在的，并被证明是内分泌分化的一个很好的标记物。出现嗜铬粒蛋白A免疫反应的肿瘤包括嗜铬细胞瘤，副神经节瘤，甲状腺髓样癌，大部分类癌，胰岛细胞瘤，垂体腺瘤以及神经内分泌癌。一般来说，chromogranin A阳性取决于内分泌颗粒的数目。包含小且分散的内分泌颗粒的内分泌肿瘤对抗chromogranin A的反应很微弱或根本不反应，这些肿瘤包括Merkel细胞癌，神经母细胞瘤以及未分化肺小细胞癌。
19 突触小泡蛋白(Synaptophysin)
突触小泡蛋白是一种38KDa的跨膜糖蛋白，最初是从神经元突触前小泡中分离出来。利用SY38单抗已证实突触小泡蛋白存在于人类神经内分泌细胞及其相关肿瘤的小泡(30-80nm)中(在超微结构下显示小泡内有透明的内容物)。突触小泡蛋白是一种高度特异且高度敏感的内分泌标记物，其表达独立于嗜铬粒蛋白或其它神经内分泌标记物。
20 中间丝(intermediate filament,IF)的联合表达
现在人们认识到一些不同谱系的非肿瘤组织至少表达一种IF，这种IF联合表达不仅是一种发生于进行分化的胚胎组织中的短暂现象，而且还出现于已停止分化的正常的成人细胞中。除了正常细胞外，IF的联合表达还出现在联合表达两种或更多IF的细胞所起源的良性和恶性肿瘤中，出现这种情况的原因是由于肿瘤细胞保留了与其起源细胞相同的IF成分，或者是由于在肿瘤细胞中出现了与其相应的正常细胞所不同的另一种IF联合表达方式。角蛋白与波形蛋白的联合表达出现在多种器官的癌中，例如肾脏、肺脏、卵巢、甲状腺。还出现在一些肉瘤中，例如滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、恶纤组、尤文氏肉瘤。据报道，角蛋白与波形蛋白的联合表达还出现在少数几例间变的大细胞淋巴瘤中。在多种神经内分泌肿瘤中可出现角蛋白与神经丝的联合表达。结蛋白与波形蛋白的联合表达出现在某些平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、促纤维生成性小圆细胞瘤中。在一些上皮样肉瘤中，偶尔出现角蛋白，波形蛋白和神经丝联合表达的报道，而在皮肤与唾液腺混合瘤中常常有角蛋白、波形蛋白和GFAP的联合表达。
最近对IF蛋白复合体在良恶性细胞中表达情况的认识表明角蛋白、结蛋白、神经丝、GFAP以及波形蛋白不能再作为上皮、肌肉、神经、胶质、间叶分化的单一标记物。尽管如此，IF蛋白联合表达并没有否定IF免疫染色在诊断病理学中的应用价值。除此之外，人类肿瘤中，IF蛋白的联合表达在这些肿瘤的鉴别诊断中以及判断不明组织来源的转移瘤的原发部位时，可能是一个较好的辅助性特征。IF蛋白的联合表达可能还会使人们认识到新的临床病理诊断依据。例如：促纤维生成性小圆细胞瘤最重要的诊断依据是肿瘤细胞内有结蛋白和角蛋白的联合表达。
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