clearsky0913

ＴＰＡ涂抹小鼠皮肤后　做冰冻切片　染炎性细胞　非常郁闷中

　ＴＰＡ涂抹后２４h取材，立即用ＯＣＴ包埋，冰冻切片，刀头零下４０度，机箱零下２０度，切４微米－８微米都试过，
切完晾１５分钟或不晾，冷丙酮固定１０分钟，室温或３７度晾4小时至过夜都试过，
　　ＰＢＳ５＊２
　　Ｈ２Ｏ２　３％　１０分钟
　　ＰＢＳ　５＊３
　　二抗血清　１：５０　半小时
　　一抗　ＣＤ１１Ｂ（染巨噬细胞）；ＧＲ１（染中性粒细胞）１：５０；１：１００；１：１５０都试过
　　ＰＢＳ　５＊３
　　二抗(兔抗大鼠ＩgG)　１：２００
　　ＰＢＳ　５＊３
　　三抗（avidin）　１：２００
      PBS   5*3
     DAB 显色
结果：在十一之前做过，片子形态尚好，很清晰，只是有些非特异．
节后用了各种条件，片子脱的很厉害，形态差，阳性也似乎没有或
很弱，不知是不是温度影响很大．物理特性所致？从３７度到室温
的影响，还是什么原因，请高手指点，不胜感激．
　　荧光的也做了，效果不好．  

2007-1-11 12:27 #1

clearsky0913

谢谢！
冰冻切片也要热修复吗？

folksmile

引用:

原帖由 clearsky0913 于 2007-1-11 15:37 发表
ＴＰＡ涂抹小鼠皮肤后　做冰冻切片　染炎性细胞　非常郁闷中

　ＴＰＡ涂抹后２４h取材，立即用ＯＣＴ包埋，冰冻切片，刀头零下４０度，机箱零下２０度，切４微米－８微米都试过，
切完晾１５分钟或不晾，冷丙 ...

我也在切冰冻的老鼠的带皮肤的组织，一般是当天切，当天染，好像还行。您说的过节后出现的问题是固定好的切片出问题，还是原始组织块重切出问题？

dingwei

冰冻切片如果没有用福马林固定不需要热修复。

fangdang

1。你所选择的一抗是否肯定能做于鼠组织？2。按道理你的片子在染色后是背景较多的，现在没有染色你得检测一下试剂盒和DAB。3。你一抗的孵育时间和环境条件没有注明，但是其他的步骤基本正常。