【紧急求助】有关石蜡切片免疫荧光结果的分析
各位战友：
本人又开始做肝脏组织石蜡切片的免疫荧光染色，用普通荧光显微镜拍照，做的是ZO-1抗原表达，二抗是cy3标记的，主要在肝细胞缝隙之间，是一种紧密连接蛋白，我的问题如下：
1、特异性染色较浅，而非特异性着色较亮（整张片子有不少亮点），原因有哪些及如何反之？
2、Zo-1蛋白主要位于细胞之间，我就不需要进行Triton X100通透？
3、我的特异性染色呈现网状，较文献中粗，不知什么原因？
4、如何最大限度减少石蜡切片免疫荧光的自发荧光和非特异性染色？
5、我的操作步骤如下，有无不妥之处？（脱蜡水化——组织细胞通透Triton X100 30min in RT——微波抗原修复6min*4次——血清封闭30min in RT——一抗孵育4度过夜，且次日37度复温——cy3标记二抗避光37度孵育1h——PBS洗后封片——荧光显微镜观察并拍片。）
麻烦大家帮忙解答以上问题和分析以下照片，谢谢指教！
[ 本帖最后由 wangh2008 于 2008-7-5 14:43 编辑 ]
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