九日

　免疫组化技术是临床病理工作中必不可少的辅助诊断技术,而抗原修复则是免疫组化成功与否的决定性因素之一。既往抗原修复液多采用柠檬酸盐缓冲液、EDTA 溶液等,但均或多或少存在某些缺点。我们利用生理盐水作为抗原修复液,发现其抗原修复效果满意,方法简单、经济实惠,并经我室6 000余例临床标本验证,现介绍如下。
1　材料与方法
1. 1　标本　所有标本均系我院外检标本,经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋, 3～5μm连续切片, 60 ℃烤箱烤片24 h备用。
1. 2　试剂　生理盐水系湖南汉森制药有限公司生产;柠檬酸缓冲液(pH 610) ; EDTA抗原修复液(pH 910) 、各种抗体及SP免疫组化检测试剂盒均购自福州迈新公司。
1. 3　仪器设备　尚朋堂SR2B20电磁炉、LGMG25510SD微波炉、苏泊尔18 cm不锈钢压力锅及耐高温塑料染色架。
1. 4　方法　切片常规脱蜡至水; 3% H2O2 阻断内源性过氧化物酶20 min;分别以生理盐水、柠檬酸缓冲液、蒸馏水和EDTA溶液作为抗原修复液(液面高度超过组织2 cm 以上) ,并分别进行如下抗原修复[ 1 ] ,再进行SP免疫组化染色
1. 4. 1　单纯加热法　将脱蜡、阻断后的切片放入盛有抗原修复液的容器中,置电磁炉上加热至沸腾,并保持10 min,待自然冷却后取出切片。
1. 4. 2　高温高压修复法　在压力锅内放入适量抗原修复液,放于电磁炉上加热至沸腾;将脱蜡、阻断后的切片装于耐高温塑料染色架内放入上述预热的抗原修复液中,加盖加阀以高火加热至减压阀开始冒汽后2～5 min熄火,待压力锅自然冷却后取出切片。
1. 4. 3　微波修复法　将脱蜡、阻断后的切片放入盛有抗原修复液的容器中,置微波炉加热使温度保持在92～100 ℃,并持续2 ×5 min,待自然冷却后取出切片。
2　结果
2. 1　对于表达强的抗原,在上述三种不同修复方法作用下,经4种抗原修复液修复后,阳性信号均定位准确,背景清晰,但蒸馏水组的染色强度低于其它三组;而生理盐水组和柠檬酸缓冲液组及EDTA修复液组的阳性强度无明显差异。
2. 2　对于表达弱的抗原,如ER、PgR、p53等,蒸馏水组几乎无阳性信号,而生理盐水组和柠檬酸缓冲液组、EDTA修复液组均可见阳性表达,且定位准确,背景清晰,无非特异性着色。
2. 3　不同修复方法中,以高温高压修复法********。
3　讨论
　　组织标本经福尔马林固定后大多数抗原决定簇被封闭,在作免疫组化标记时必须进行抗原修复,以暴露抗原决定簇[ 2 ]。抗原修复方法较多,其中抗原热修复方法在各实验室几乎已成常规,但其使用的抗原修复缓冲液和热处理方式存在差异。其中抗原修复缓冲液以柠檬酸缓冲液和EDTA溶液为多;热处理方式有利用微波炉和高压锅加热等,且至今的脂肪组织,需要水洗冲去沉淀的甲酸,甲酸的沉淀将会影响染色的结果. 在固定后脱水前将脂肪组织经过30分钟的水处理,可达到更好的切片染色效果。
3. 3　脂肪组织的脱水应从低浓度乙醇开始,在95%乙醇中时间应尽量延长。
3. 4　浸蜡:为了使石蜡的分子很快的浸透到组织中去,有人主张在第一步石蜡内加放一些二甲苯,或者是以熔点较低的软石蜡作为第一步,然后再换熔点较高的硬石蜡作为第二步、第三步[ 3 ]。
3. 5　切片时应注意脂肪组织切片捞片时水温应低一些,以43 ℃为宜,水温过高,摊片时蜡片极易向四周散开,不仅造成捞片困难,且使组织结构松散,不利诊断。
3. 6　在进行HE染色时,苏木素染色宜深一些,染色前最好将苏木素染液先行过滤,染色过程中盐酸乙醇的分化较为关键,分化一定要恰到好处。
作者：杨　军
此文转载于《临床与实验病理学杂志》2009年

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