冷冻切片的制作体会及常见问题分析（转载杂志文章）
此文转载于《诊断病理学》杂志2008年2期
冷冻切片的制作体会及常见问题分析
范 慧,陈立华,刘 宇 (山东省立医院病理科, 济南 250021)
1 冷冻切片制作体会
111 掌握送检组织的性质 由于各种组织的形态结构和成织取成方形,切片时将组织上下对角放置,这样作用于刀片的阻力较小,比较容易切成平整的薄片;如果组织冻过头了,切下的组织成一丝一丝的不能成形,这时可用手贴在组织上或将组织拿到冷冻切片机的外面稍化冻再切,可切出完整的切片。冷冻室温度控制在- 18 ℃左右,冷冻时间2 min。
11113 脂肪组织 由于脂肪组织冰点低,只有< - 40 ℃才能冻硬,单压缩机的冷冻切片机达不到其冷冻温度,因此不能制片。双压缩机的冷冻切片机机头温度可在2～3 min内降至- 50 ℃,把冷冻托夹在机头的样本夹上,等组织冻硬后即可切出完整的切片。另一种方法是,将组织放入液氮冷冻后,用普通的冷冻切片机切片。需注意:不要冻过头,组织放入液氮后2～3 s 就要拿出来看一下,只要有4P5 的组织已经冻住就可以了,待冷冻托拿出后刚好全部冻住,否则会引起组织发脆或冷冻托与组织分离。
11114 细胞致密的组织 如肝、脾、淋巴结及脑组织,这些组织不能等冻硬才切片,一般冻到八成即可切片,如果冻得太硬,切片时很脆,镜下形成一道道的裂隙,破坏了组织结构,影响诊断,尤其是淋巴结。冷冻室温度控制在- 16 ℃左右,冷冻时间1 min。
112 切片过程要注意观察 切片时,先将组织轻修后再观察切面,看有无包膜、结节、钙化等;如果标本无需特别注意则再深修至****切面,切片后贴片。有包膜的一定要切完整,小的结节或重点病变部位要切到,不要把小结节修没了,造成漏诊、误诊,必要时多个切面贴片。切片要达到平整、无皱褶、无刀痕,厚薄均匀。
113 冷冻切片的固定 切片后立刻把载玻片放入固定液中,不要等切片干后再固定,否则容易发生细胞退变。切片后不立即固定,电镜下可观察到的溶酶体、线粒体等细胞器溶解消失,因此及时固定对保持细胞的结构非常重要。固定不好,细胞核的着色力下降,结构模糊不清。常用的固定液有无水乙醇、丙酮、甲醇、AF 液。这4 种固定液对冷冻切片的固定效果都很好,固定时间为30 s～1 min。
114 染色的注意事项 新鲜组织对染料的亲和力较强,苏木精染30 s～1 min即可,需注意的是苏木精的应用时间不宜过长,宜< 1 个月。使用时间过长,出现泛染现象,细胞核、浆都被染成蓝色,伊红不着色,细胞结构模糊不清。②分化要适当,分化过度细胞核着色浅,分化不足细胞核的染色质看不清楚,用015 %～1 %的盐酸乙醇分化2 s 即可;1 %的伊红水溶液染色2 s 即可;低浓度的乙醇对伊红有脱色作用,可从90 %的乙醇开始脱水,依次是95 %乙醇、无水乙醇。
2 常见技术问题及处理方法
211 组织挤压、皱缩 常见于组织结构软硬不同的组织,如皮肤。解决方法:将表皮面放在标本的上端,先切较软的皮下组织,依次切真皮、表皮,同时用毛笔轻轻展开,或用抗卷板才能切出完整的切片。
212 组织破碎或形成空洞 常见于甲状腺等有腔洞的组织。组织冷冻过头,使之发脆就会破碎形成空洞,这时可用手贴在组织上或用嘴向组织哈气稍加温使其软化即可切出完整的切片。
213 组织贴附不平或有皱褶 切片切好后用载玻片贴片时手不能颤抖,而且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动作。
214 脱片 冷冻切片一般不会脱片,偶见于坏死组织或含水量大的组织,如子宫肌瘤黏液变性时。解决方法:首先切片不能太厚,其次切片固定后用吹风机吹干再染色。
215 出现冰晶 冰晶是组织在冷冻固化过程中,由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,使细胞质和组织间隙内未结合的水逐渐析出形成。解决办法: ①取材大小、厚薄要适宜,过大过厚影响冷冻速度; ②取材时避免混入水分; ③冷冻时间要短,只有速冻才能减少组织内的冰晶形成,最好将速冻头压在组织上,冻好后就可切片,对容易形成冰晶的肌肉、脑组织应采用干冰或液氮冷冻,以减少冰晶的形成。
216 细胞染色过浅或模糊不清 适当延长固定、染色时间,当苏木精染色力下降时及时更换。脱水流程不能太快并定期更换脱水液。
我科通过上述对冷冻切片制作过程的探索和改进,使冷冻切片的质量有明显提高,值得推广应用。
