九日

此文转自《诊断病理学杂志》2004年2月第11卷第1期

石蜡组织提取DNA 4 种方法的比较
作者：王丽江,甘润良,唐运莲,黄幼生,周建国

　目前,从石蜡包埋组织中提取DNA 在数量和质量上都不能令人满意〔1〕。而按常规酚氯仿法抽提DNA ,过程长,有毒性,用于PCR 扩增,成功率较低。我们应用4 种不同方法从石蜡包埋人胃癌组织中提取DNA ,用于PCR 扩增,从中摸索出一个简便,经济,实用的方法,现报道如下。
1 　材料与方法
111 　材料　选用南华大学附属第一医院病理科1999 —2000年存档胃癌石蜡包埋组织块,共30 例。所用物品包括PCR仪(Biometra) 、蛋白酶K(Merck 公司) 、Taq DNA 聚合酶(北京华美) 、Chelex2100 (Bio2Rad Laboratory) , EX2WAXTM DNA 提取试剂盒(Serologicals Company , Lot # 13A001)112 　提取DNA 　将每例石蜡包埋组织块切片10μm厚,分装于4 个EP 管中,每管5 片,切不同病例的蜡块时用二甲苯擦洗刀片两遍,以免交叉污染。先统一去蜡(试剂盒法除外) ,在每管中加入二甲苯1 ml 置于恒温摇床中, 37 ℃20 min 后离心12 000 r/ min ,10 min ,去上清,加入新鲜二甲苯重复一次。再用无水乙醇洗涤两次以脱去二甲苯,离心后弃上清,在空气中干燥沉淀。
11211 　Chelex2100 法　用200μl 的5 % Chelex 提取液(5 %Chelex ,012 %SDS ,10mmol/L Tris pH 810 , 015 mmol/L EDTA
pH 810) 悬浮沉淀,加入5μl 蛋白酶K(20 mg/ ml) 消化,55 ℃振摇3 h 后溶液澄清。98 ℃热10 min ,离心取上清(DNA 在上清液中) ,4 ℃储存备用。
11212 　酚2氯仿法　在EP 管中加入200μl 蛋白酶K缓冲液(50 mmol/L Tris2HCl pH 810 , 5 mmol/L EDTA pH 810 , 012 %Tween220) 及5μl 蛋白酶K(20 mg/ ml) ,置55 ℃水浴振摇过夜,取出后煮沸10 min ,离心。取上清,用等量酚氯仿异戊醇抽提2 次。加215 倍冰无水乙醇( - 20 ℃) 和1/ 10 体积3 mol/L乙酸钠沉淀DNA , - 20 ℃静置3 h ; 取出后低温离心14 000
r/ min ,15 min ,弃上清。用70 %乙醇洗涤沉淀2 次,室温通风干燥、沉淀后用50μl TE 液(pH 810) 溶解DNA 1～2 d , 4 ℃保存。
11213 　试剂盒法　按试剂盒说明书进行。
11214 　简单消化法　按酚氯仿法灭活蛋白酶K,离心后取上清即为模板DNA1
113 　PCR 扩增　选择染色体1q21 区域微卫星多态性位点D1S305 引物1 对,序列为CA 链5’ccagnctcggtatgtttttacta3’,GT链5’ctgaaacctctgtccaagcc3’,扩增片段为156176bp ,由上海生物工程公司(Sangong) 合成。反应体系为25μl ,10 ×PCR 反应缓冲液215μl ;25 mmol/L MgCl 2115μl ;10 mmol/L dNTP 015μl ;10μmol/L 引物各1μl ;模板2μl ;5μl Taq 聚合酶0125μl ,余下由灭菌去离子水补足。经94 ℃变性5 min 后进入循环:94 ℃变性1min ;56 ℃退火45 s ;72 ℃延伸30 s ,完成40 个循环后,于72 ℃下延伸10 min。每次PCR 反应均设阳性、阴性对照。
114 　PCR 产物　115 %琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物,成像。
2 　结果
分别用4 种不同方法从30 例胃癌石蜡组织标本中提取DNA ,进行PCR 扩增,见表1。
表1 　4 种不同方法提取DNA 经PCR扩增阳性率比较方法总例数阳性例数( %)
Chelex2100 30 17(5617) 3
酚氯仿30 3(1010)
试剂盒30 18(6010)
简单消化30 1 ( 313)
　　3 与酚氯仿法与简单消化法比较差异极显著( P < 0101)
3 　讨论
用聚合酶链反应(PCR) 法从石蜡包埋组织中提取DNA扩增特异性片段在病理诊断中有重要意义,关键技术是得到较为完整的基因组DNA。在组织固定、包埋以及DNA 提取
过程中,导致DNA 降解的因素有很多〔2〕,我们认为制备适合PCR 扩增的DNA ,主要困难是如何去除蜡质和纯化DNA。在实验中,我们分别采用4 种方法从30 例胃癌石蜡标本中提
取DNA。其中简单消化法的阳性率最低,阳性扩增出的条带亮度比其他3 种方法弱,这可能是由于该方法缺少纯化步骤,DNA 附着蛋白质去除不净而影响DNA 变性和与引物的结合;也可能是由于标本中残留的固定剂等成分对TaqDNA聚合酶的抑制所致。酚氯仿法为经典抽提法,DNA 纯度较高,但是该方法步骤繁多,耗时长,在抽提过程中损失较多
DNA ,故文献报道与本实验PCR 扩增的阳性率均不高〔3〕,提示该法不适合从石蜡组织中制备DNA。商业试剂盒方法虽然简单快捷,DNA 纯度好,PCR 扩增效率高,但是价格昂贵且反应次数少,不适合大量应用与推广。Chelex2100 是一种金属离子螯合剂,能与Mg2+ 、Ca2 + 等核酸反应必需的二价金属阳离子螯合,从而保护DNA ,并减少由降解的DNA 片段形成的杂带。在本研究中,我们参考国外文献〔4〕,结合实际情况做了较大改进。该法简单快捷,整个提取过程仅用4h ,且转管少,减少了实验耗材以及操作过程中可能的污染。所用试剂中无有机溶剂,较为安全可靠。该提取方法的PCR 扩增效率可以与试剂盒法相媲美,二者效率相当,但是价格却相差甚远。所以,我们认为从石蜡组织中提DNA ,Chelex2100 法便捷、安全、高效、价廉,适合实验室推广应用。