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[求助]甲基绿-派洛宁染色

[求助]甲基绿-派洛宁染色

丁老师和各位高手:我现在正在做甲基绿-派洛宁染色,但总是染不出书上所说的效果,尤其是甲基绿老是染不上色.不知该怎么办??染液怎么配??现在很苦恼.盼回复!!!感谢先.

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[求助]甲基绿-派洛宁染色

  转丁老师的贴:
甲基绿派洛宁法(改良Cook,1974)
试剂配制:
(一)2%甲基绿水溶液:
甲基绿(methyl green)1g
蒸馏水加至50ml
用三氯甲烷抽提,方法详后。
(二)5%派洛宁水溶液:
派洛宁G(pyronine G)1g
蒸馏水加至20ml
(三)0.2M醋酸盐缓冲液(pH 4.8)
0.2M醋酸液41ml
0.2M醋酸钠液59ml
(三)甲基绿派洛宁染液:
2%甲基绿水溶液(经抽提)    5ml
5%派洛宁水溶液              1ml
蒸馏水                       12ml  
0.2M醋酸盐缓冲液(pH 4.8)  18ml
甲基绿水溶液的抽提:甲基绿为绿色粉末,属三苯甲烷染料,这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用,甲基绿就比甲基绿后,所引进的甲基连接得并不牢固,容易从甲基绿中脱失。另一方面,在甲基化过程中,还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿,因此,也有人认为甲中,常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是,也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物,甲基绿在储存过程中,会不断产生甲基紫。因此,在配制试剂时,必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来,才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入三氯甲烷20ml充分摇荡混合,使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把如此反复更换三氯甲烷,直到三氯甲烷无紫红色为止,即可得到得纯的甲基绿溶液。
操作步骤:
1、新鲜组织固定于Carnoy氏液(4℃)3~6小时,经95%酒精和无水酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。
2、切片经二甲苯脱蜡至蒸馏水。
3、置入甲基绿派洛宁染液于室温染30~60分钟。
4、取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液。
5、用丙酮迅速分化。
6、转入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。
7、二甲苯透明2~3次。
8、中性树胶封固。结果:存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色,胞核染色质内的脱氧核糖核酸绿色或绿蓝色。
对照方法:
1、取另一连续切片用核糖核酸酶(rihonuclease)1mg/1ml于37℃温箱内消化3小时,蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。
2、切片在10%高氯酸(prechloric acid)于4℃处理12~18小时,水洗后用1%碳酸钠液中和2分钟,流水冲洗5分钟,再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。经上述方法之一处理后的切片就为阴性。
注意事项:
1、组织不宜用甲醛固定,应选用Garnoy氏固定液,因为酒精和醋酸能较好地保存核蛋白。
2、Garnoy氏液固定标本的时间不宜太长,超过一天则染色效果不理想。
3、要注意试剂的质量,特别是派洛宁,常常不同批号的染料,染色的效果不同。甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当。
4、染色液的pH应为4.8左右,如pH过低,甲基绿染色效果差;pH偏高,则派洛宁染色效果不良。
5、丙酮分化时间要很好掌握,时间不宜太长。
6、配妥的甲基绿派洛宁染液用后放冰箱保存,约可使用数周。
染色原理:对此法的染色原理,目前了解得还不够清楚,一般可从下面两方面理解。1、电离作用:脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基,又有碱基,故为两性电解质。在一定的条件下,可以电离而带电荷,因此都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后,都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后,在五价氮处产生二个正电荷,碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷,碱性较甲基绿弱,在染色时二者进行竞争,碱性较强的甲基绿就与胞核(等电点pH3.8~4.2)进行极性吸着而结合,碱性较弱的派洛宁与胞质(等电点pH4.6~5.2)吸附结合。2、聚合作用:甲基绿对聚合高的DNA有亲和力,派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。因此,思虑在绿选染DNA,而派洛宁选染RNA。应用:PNA主要存在于胞质及核仁内,它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生,胞质蛋白质合成亢进时,核仁和胞质的PNA增加。因此,恶性瘤细胞核仁巨大,胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白,胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此,这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱,是蛋白质合成增强的标志。


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