manbeing

我科室正在做宫颈液基细胞学涂片的免疫组化，一抗是PI3K（Biogenex公司订购），可是做了几次效果总是不好！DAB显色后一片黄染！烦劳帮我指点一下：做免疫组化，细胞学的固定需要什么固定？涂片后需要烤吗？温度及时间有什么要求？因为做过几次细胞有些掉！修复当如何修复？我们都是用柠檬酸盐抗原修复液修复的 ！

[ 本帖最后由 manbeing 于 2008-10-9 12:59 编辑 ]

fangdang

我实验室做免疫细胞化学是用95％或中性福尔马林固定。而且在酒精灯上过火（不能对者火焰长烤），如果热修复会掉些细胞，但是多数细胞都在呀！修复要看抗原！但是都有做细胞通透（这时细胞膜可是完整的半透膜）。
DAB一片黄染：1.抗体浓度过高（结合时间过长）。2.干片。3.显色时间过长。但以上都是肺特异染色。关键要看有无真正阳性出现？！

依米花

染色步骤：
􀁺 取出在乙醇中固定的细胞涂片，至 PBS 液，冲洗；
􀁺 3%过氧化物酶阻断剂 10 分钟；PBS 冲洗3 次；
􀁺 强力阻断剂（Power Block），10 分钟，不冲洗；（此步为蛋白阻断）
􀁺 滴加一抗，室温孵育 30 分钟或按抗体说明书要求；PBS 冲洗3 次；
􀁺 Super Enhancer （BioGenex 公司，超级增强剂），室温孵育20 分钟；PBS 冲洗3
次；
􀁺 滴加 Polymer HPR 检测系统（BioGenex 公司），室温孵育 30 分钟；PBS 冲洗3 次；
􀁺 DAB 显色；
􀁺 苏木素复染；
􀁺 脱水，封片

依米花

结合TCT 细胞检测技术进行ICC 染色的步骤流程
  免疫细胞化学染色检查
1）涂片的准备：
采用 ThinPrep 2000 设备，将HE 染色发现可疑恶性瘤细胞的样本的剩余保存液再制作多张
涂片。
适用于：细胞数量较多的样本 （宫颈细胞标本、胸腹水脱落细胞等）：
采用发现有可疑恶性瘤细胞的涂片的剩余保存液，再制备所需数量的涂片进行 ICC 染
色，一份保存液至少可以制备10 张以上的同等品质的涂片；
2）HE 涂片褪色
适用于：细胞数量少，难以制备出具有同样可疑恶性瘤细胞的涂片时（如：尿液等）。
可采用对脱落细胞学涂片 HE 染色脱色后行 ICC 的方法。其中以低浓度盐酸乙醇脱色效果
最佳。
方法：
1% 盐酸乙醇脱色，镜下控制至切片几近无色，约需5 min；
2% 草酸水溶液浸泡 3~5 min；
自来水稍洗，蒸馏水洗 3 min。
制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫组化染色过程中容
易脱片，因此，操作时应轻柔，涂片干燥要充分。②为节省试剂和便于镜下观察，可在细胞
集中的圆圈中间以Pap 笔划线，无异常细胞的一侧成为自然阴性对照。
2）ICC 染色
染色步骤说明及规范：
ICC 染色目的：鉴定细胞的种类、分化程度、表面抗原特点以及肿瘤结构成分改变等
染色步骤：
􀁺 取出在乙醇中固定的细胞涂片，至 PBS 液，冲洗；
􀁺 3%过氧化物酶阻断剂 10 分钟；PBS 冲洗3 次；
􀁺 强力阻断剂（Power Block），10 分钟，不冲洗；（此步为蛋白阻断）
􀁺 滴加一抗，室温孵育 30 分钟或按抗体说明书要求；PBS 冲洗3 次；
􀁺 Super Enhancer （BioGenex 公司，超级增强剂），室温孵育20 分钟；PBS 冲洗3
次；
􀁺 滴加 Polymer HPR 检测系统（BioGenex 公司），室温孵育 30 分钟；PBS 冲洗3 次；
􀁺 DAB 显色；
􀁺 苏木素复染；
􀁺 脱水，封片

KETTY

挺详细

依米花

引用:

原帖由 KETTY 于 2009-9-1 15:17 发表
挺详细

谢谢！正好有这样的资料，助人为乐啊！

yoyo751102

做涂片的免疫组化可以不用修复了，背景黄，可能是阻断液的浓度低或阻断时间不够、抗体孵育时间过长、DAB显色剂的浓度过高，这都会影响背景的！而且每一步都要用PBS液清洗几次。还有如果涂片太厚也会导致掉片的。

yoyo751102

做涂片的免疫组化可以不用修复了，背景黄，可能是阻断液的浓度低或阻断时间不够、抗体孵育时间过长、DAB显色剂的浓度过高，这都会影响背景的！而且每一步都要用PBS液清洗几次。还有如果涂片太厚也会导致掉片的。