junyi4444

最近的免疫组化片子都是背景偏深，怀疑是内源性生物素的问题。我们的方法是片子脱蜡如水后，进入3%H2O2浸泡10分钟。H2O2大概是一个星期换一次。请问各位老师你们都是怎么坐的呢？背景偏深还可能是什么呢？

fangdang

你把内源性生物素和内源性过氧化物酶弄混了。

shanghainese

引用:

原帖由 junyi4444 于 2008-11-12 20:20 发表
最近的免疫组化片子都是背景偏深，怀疑是内源性生物素的问题。我们的方法是片子脱蜡如水后，进入3%H2O2浸泡10分钟。H2O2大概是一个星期换一次。请问各位老师你们都是怎么坐的呢？背景偏深还可能是什么呢？

背景偏深有很多原因。除了内源性生物素和内源性过氧化物酶外，抗原热修复不当，一抗，二抗，Streptavidin-HRP 和DAB 不好等均可造成背景偏深。

junyi4444

对，是内源性过氧化物酶。我搞混了。那内源性生物素是什么东西呢？怎么处理呢？内源性过氧化物酶老师们是怎么处理的呢？

shanghainese

引用:

原帖由 junyi4444 于 2008-11-13 21:18 发表
对，是内源性过氧化物酶。我搞混了。那内源性生物素是什么东西呢？怎么处理呢？内源性过氧化物酶老师们是怎么处理的呢？

内源性过氧化物酶你已经处理了。

fangdang

正如shanghaineses老师所说的－－－－背景偏深有很多原因。除了内源性生物素和内源性过氧化物酶外，抗原热修复不当，一抗，二抗，Streptavidin-HRP 和DAB 不好等均可造成背景偏深。
你可以一个个排除：
内源性过氧化物酶通常存在于红细胞和坏死组织中，也就是说你在片子可以观察到红细胞显棕色，才可能有过氧化物酶的存在。。。。。。检测方法：修复后不加一抗和检测放大系统直接加DAB会出现背景。。。。
内源性生物素，是基于使用生物素系统才会出现的，检测方法：修复后不加一抗直接加检测系统中的酶后加DAB组织片显色。。。。。
你还要考虑一抗浓度过高、过孵育、孵育温度，DAB也一样。逐个排除。深究出现背景的可能你的免疫组化操作可以上一个台阶。