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抗 原 修 复
抗原修复技术及其在免疫组化中的应用


福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，通过机械的方法断开因福尔马林固定的导致的抗原表位和不相关蛋白间的交联键，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使抗体更好的渗透，与表位结合。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施，AR-IHC已广泛应用于临床的研究中。修复方法多种，主要有加热修复和酶修复。

修复方法


I. 加热AR技术
可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。

微波加热方法 切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却30分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

高压热修复 切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

煮沸热修复 切片脱蜡至水后，放入盛有0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。该方法效果较微波和高压修复差。

II. 非加热AR技术
非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断组织固定形成的醛键，修复抗原。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。由于酶消化过渡会造成组织损害，应掌握消化时间。消化后应充分洗涤。
胰蛋白酶消化法 用0.1%胰蛋白酶，将切片放入湿盒内37℃温箱中消化5-30分钟。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%至0.25%。
胃蛋白酶消化法 用0.4%胃蛋白酶液，37℃孵育10-180分钟即可。
链霉蛋白酶消化法 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1％，消化时间20min。
蛋白酶K 用0.3mg/ml 37℃消化6-20mins，蒸馏水洗；95C加热3mins, 灭活残余的蛋白酶。一般用于细胞内抗原。
皂素（Saponin） 一般使用浓度为2~10ug/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

抗原修复的方法选择
抗原修复关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。不适当的抗原修复方式会导致染色弱阳性。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。不适当的抗原修复方式会导致染色弱阳性。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索确定。使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。消化时间和组织固定的长短呈正比。
在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应。以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。
缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。

AR应注意的问题
加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，修复液的温度；AR液的PH值、浓度、化学成分；片子的数量；微波的瓦数也是重要的影响因素之一。使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准。修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。有人使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L Tris-HCL缓冲液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修复抗原，发现其阳性强度逐渐增强。明显的抗原变性发生在70℃-90℃，但是福尔马林固定的蛋白具有更强的热稳定性。蛋白交联可能对抗原表位有保护作用。抗原修复时温度98℃为宜，避免强烈沸腾造成脱片。
高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决，有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示。对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内，例如P53、PcNA、Ki-67等。有些抗体(如Cytokeratin、Collagen IV、FVIII、Laminin、EGFR等)用于石蜡切片的免疫组化实验时，需要用酶对组织进行消化，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度。有些抗体(如ER、PR、Ki-67、P53、C-myc、Rb等) 用于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度。
抗原修复后，切片可放在冷PBS中过夜。PBS弱碱性，会导致一些组织脱片。对ER/PR研究要慎用。
用酒精等某些非交联固定剂固定也要修复。如果用Bouin's 或Gluteraldehyde固定，并在Bouin's 或Gluteraldehyde中修复，时间可以调整（7-10mins）. Bouin's是多聚甲醛，修复时间较短；Gluteraldehyde是一种超交联剂，需时较长。