lulu~

最近在做ATPase活性组织化学染色，用的是钴钙法染冰冻切片

材料是动物的肌肉组织

出现的比较严重的问题有：
1、出现大量空泡，应该是冻结不良产生的
可能的失误：
我采样时用锡箔纸包好组织块然后直接放入液氮，冻结好后放入-80℃冰箱。（也许应该用液氮-异戊烷冷冻后再放入-80℃冰箱，另外请问OCT包埋剂到底该什么时候用）
去切片时因为病理实验室离我的实验室还比较远于是用冰盒装着碎冰把组织带到目的地然后放入-20℃（当时用手摸感觉组织块还是硬的，以为没化，以后要用液氮运输了）
2、染色
虽然用了9.4、10.5、11.0、11.5、12.0的梯度pH来摸条件但是不知道是不是由于空泡太大，我觉得染上的部分颜色似乎都是差不多的深浅，就是说还没法分型

下边是我用的protocol，请大家帮我看看具体有哪些问题，感激不尽啊~~~

ATP酶染色
（一）试剂准备
1、碱性预孵育液：
0.1mol/L巴比妥钠4mL（最佳，比PBS更能保护ATPase活性），0.18mol/L CaCl2 4mL，蒸馏水12mL，调pH至 10.4。（pH值由预实验确定，可能会在10.5~11）
2、孵育液：0.1mol/L 巴比妥钠4mL，0.18mol/L CaCl2 2mL，蒸馏水14mL，三磷酸腺苷二钠盐（ATPase Na2）50mg（每次最多配100mL，可在4℃保存1个月）， 以0.1mol/L NaOH调节pH至9.4~9.7
3、其他：2%氯化钴，1%硫化铵，酒精，二甲苯，中性树胶。
（二）、染色（所有过程除水洗外全部使用滴染法，剂量200-500μL）
1、切片在室温下，置碱性预孵育液中15min。
2、切片放入37℃的ATP酶预孵育液中45min。
3、1%氯化钙液洗涤1次，10min，15min时再补加一次1%氯化钙液（或重复三次）。
4、切片放入2％氯化钴（或氯化钙）中，3min。
5、0.01mol的巴比妥钠液洗切片8次，每次0.5min。
6、蒸馏水快速浸置洗涤，拿出。
7、1％**硫化氨溶液洗涤1min（1mL硫化铵/100mL蒸馏水，必须新鲜）。
8、流水充分冲洗（决定切片美观程度）。
9、电吹风干燥，梯度酒精（70%,80%,95%,100%）各3分钟脱水，二甲苯：酒精=1：1（可略），纯二甲苯，纯二甲苯各15min透明，中性树胶封片，镜检。
（三）、注意事项  CaCl2浓度在孵育前后不能降低，否则产生的磷酸根离子不能被完全捕获而影响准确定位。如染色效果不好可在孵育前将切片放入1％CaCl2溶液中，37℃作用5分钟。

附：
酸性预孵育液：
醋酸巴比妥钠：醋酸钠1.94g，巴比妥钠2.94g，蒸馏水100mL。
0.1mol/L醋酸巴比妥钠5mL，0.18mol/L-1 CaCl2 10mL，蒸馏水8mL。
酸性预孵育液1: 0.1mol/L HCI调整pH至4.25。
酸性预孵育液2: 0.1mol/L HCI调整pH至4.6。
（二）、染色
1、切片在室温下，置碱性预孵育液中15min。
切片在室温下，置酸性预孵育液1中5min,用碱性预孵育液轻轻洗涤30s-1min。
切片在室温下，置酸性预孵育液2中5min,用碱性预孵育液轻轻洗涤30s-1min。
2……（同）