常规HE染色使用氨水或饱和碳酸锂溶液进行返兰，是利用两种溶液的碱性。
苏木素是苯并吡喃类生物染料，这种染料在不同的PH之中呈现不同的颜色，酸性时为红色，中性时为紫色，碱性时为蓝色。
苏木素染液中加入冰乙酸用以减低非特异性染色，呈酸性；之后的分化液含有盐酸，呈酸性；
所以染完苏木素分化后进行一步“返兰”，就是用碱性溶液中和掉组织中的酸性，使苏木素呈现蓝色。如果不用氨水、碳酸锂溶液返兰，用温水、流动自来水浸泡时间长一些也能去除组织中的酸性，使苏木素返兰。
返兰之后要充分将组织中多余的碱性溶液充分洗净，因为残留的碱性溶液会影响伊红的着色。
伊红是通过伊红分子中的羧基电离后带负电，与蛋白质中带正电的氨基端或侧链氨基（-NH4 ）结合，使蛋白质染色。
如果碱性溶液在组织中残留，蛋白质是两性化合物，在碱性环境中，蛋白质就出现羧基端电离呈负电，氨基端不带电，整个蛋白质分子呈负电。伊红是负电，蛋白质是负电，负负相斥作用，伊红就染不上了。
在返兰后清洗的实际操作中，容易出现的现象是碱性返兰液清洗不彻底，组织局部碱残留，就呈现出同一片组织内局部红局部不红的现象了。
尽管氨水和饱和碳酸锂都能达到返兰的目的，基于这两种物质不同的化学性质，这两种溶液在使用过程中还是有一些差异的。
氨（NH3）： 易溶于水成为氨水（NH3H2O,也称氢氧化铵），氨水具有强碱性。氨的分子结构：NH3，N原子为不等性sp3杂化，4个杂化轨道中的3个 分别与H原子形成σ键，整个分子呈三棱锥形结构，N原子的另一个sp3杂化轨道被一对孤对电子占用，位于棱锥形的顶端。
碳酸锂（Li2CO3）：强碱弱酸盐，具有碱性。1g溶于78ml冷水。
碳酸锂在水中的溶解速度比氨水要慢，所以返兰后浸泡清洗的时间要稍长一些。无论哪种返兰液，都要保证清洗干净。个人经验：冷水浸洗3次，每次1分钟。第2第3次可以用40度左右的温水清洗，可以缩短时间，效果不错。
N的电负性是3.05，并且氨基有一对孤对电子， 使得氨基中的N极易与蛋白质中的H形成氢键。氨基这个特性引起组织中蛋白质的二级三级构象发生改变，导致蛋白质出现“松解”的现象。组织与载玻片粘连，组织与载玻片形成氢键起到重要作用。氨可以破坏组织与载玻片的氢键，使组织与氨形成氢键。这也就解释了为什么用氨水进行返兰，组织容易掉片的原因。
基于氨基这样的特性，有兴趣的同志们可以思考一下，为什么在免疫组化修复液中使用EDTA修复液的修复效果要强于柠檬酸修复液，为什么PH值越大的修复液修复效果越强？
同志们，化学是基础啊！有时候是可以达到“一通百通”的效果的……
个人观点，希望大家辩证看待！
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本帖最后由 王华 于 2012-10-14 11:51 编辑 ]
