离觞

各位老师，我最近在试验中遇到了一些问题，想请教一下。
我要做的是小纤维神经病患者的皮肤活检，取材是位于外踝上方10cm处的皮肤，直径3mm左右，切到皮下脂肪层。然后做冰冻切片，免疫组化，DAB显色，主要是想观察在表皮和真皮交界处的神经末梢的小纤维的数量和密度。
目前遇到的主要问题有：
1、我目前查到的文献都是说取组织后4%多聚甲醛固定4℃24小时，然后冰冻切片机切片，厚度要求至少50um，然后做免疫组化。但是我联系我们医院病理科的老师时他们说冰冻切片不能用固定液固定，要新鲜组织直接切，而且冰冻切片不能做免疫组化，当时我的组织已经用病理科配好的固定液也就是10%的甲醛泡了，所以想请教一下，做皮肤的冰冻切片到底要不要固定，固定液不同有什么影响吗？
2、关于切片的厚度，我要切的确实是50um，是比较厚的，这个厚度我们医院没有人切过，我咨询病理科和神经生物的老师时他们也表示过怀疑，但是文献上明确要求至少50um，甚至可以切到80—100um。我要观察的是皮肤的表皮和真皮交界处的神经末梢密度和数量，是不是切得太薄了不容易看到？（这是我个人的理解，没查到文献上有专门的解释）
3、关于切片易碎的问题，不知道是不是皮肤组织比较疏松的原因，我找的是一位神经生物专门做冰冻切片的老师帮忙切的，但是在贴片时仍然发现组织破碎比较明显，不知道其他学校的实验室做冰冻切片用不用OTC包埋？是不是包埋后再切会好一点？切好后做免疫组化时怎么去除胶状的OTC？
4、皮肤组织贴片时除了毛笔还有什么比较好的工具吗？我用毛笔贴片时组织总是粘在毛笔上，稍微一抖组织就碎了，不好贴。
5、我第一次是用的漂染法，染色还可以，但是组织破损很严重，第二次是先贴片然后在加抗体和染色，但是发现染色的效果很不理想。所以想问一下，到底用什么方法比较好？另外冰冻切片贴片时要不要37度烘干？如果需要大概要多长时间？
问题比较多，麻烦大家帮我解惑，非常感谢！