九日

此文转载于《临床与实验病理学杂志》　2008 Aug; 24 (4)

醇溶性伊红Y染液配制与染色方法
作者：程国平1 ,徐建勤2
　材料与方法
1. 1　试剂　醇溶性伊红Y(上海三爱思试剂有限公司) 1 g,95 %乙醇1000 ml。
1. 2　设备　ZD2420恒温水浴箱(杭州中拓仪器有限公司) 。
1. 3　染液配制
1. 3. 1　醇溶性伊红Y储备液　①依次将乙醇和伊红倒入2 000 ml容积的三角烧瓶,并将烧瓶置于恒温水浴箱内加温至40 ℃左右。②间歇用玻璃棒搅拌乙醇直到伊红完全溶解,取出烧瓶使溶液降至室温。③这时溶液内有少量伊红颗粒析出沉淀,此即醇溶性伊红Y乙醇饱和储备液,可在室温下保存数周。
1. 3. 2　醇溶性伊红Y染色液　①取储备液1份,加入等量95%乙醇。②再按此溶液每100 ml加1滴冰醋酸即成醇溶性伊红Y染色液。
1. 4　染色步骤　①常规切片脱蜡至水,苏木精染核并流水冲洗充分蓝化。②切片预先入95%乙醇处理1 min。③再入醇溶性伊红Y染色15～30 s。④不经水洗直接浸入85%乙醇分化1 min。⑤常规脱水、透明、封固。
2　结果
用此法配制的醇溶性伊红Y染色液使用期长,染色速度快。结合正确的染色方法时,切片分化不易脱色,颜色清晰艳丽,与蓝色的细胞核对比突出,且长期保存也不易褪色
　讨论
醇溶性伊红Y的分子式为C20 H8Br4O5 ,在乙醇中电离成C20H6Br4O5- (色酸负离子)和2H + ;水溶性伊红Y分子
式为C20 H6Br4O5Na2 , 在水中电离成C20 H6Br4O5- 和2Na + [ 1 ] 。前者溶液内无Na +存在,加之染色液配制简单快捷,因此较后者更适合作为常规胞质染料。但实际应用中,醇溶性伊红Y染色液普遍存在使用期短、难染色、易褪色等现象。我们认为,此种现象一般由以下几种原因引起。①溶剂种类:醇溶性伊红Y几乎不溶于水和低浓度乙醇[ 2 ]。如用纯乙醇取代95%乙醇配制染液,也会影响伊红溶解度,且染色后切片经低浓度乙醇分化易脱色。②染色液浓度:室温下醇溶性伊红Y在95 %乙醇中较难溶解,远低于有关文献记载的溶解度(0145 g/100 ml) [ 2 ] ,这可能与染料的生产工艺有关,所以在室温下直接配制染色液往往达不到目标浓度,切片染色较淡。③冰醋酸的量:适量的冰醋酸能使染色液保持比胞质等电点略为酸性的环境但pH值比染色体等电点高) ,从而使胞质碱式电离并带正电,可被带负电的伊红色酸负离子染色[ 3 ]。不加或加入少量冰醋酸,伊红仅通过渗透或弥散作用很难染色,而且和组织结合不牢固,分化后易脱色。加入过量冰醋酸,一方面使染色体也发生碱式电离带正电,造成核、质对比不清;另一方面抑制了伊红电离,形成醇溶性伊红Y沉淀,导致染色液失效。④染色前、后处理:苏木精染核后,切片未采用流水冲洗蓝化,残存的酸或碱性物质易引起伊红褪色;或者水洗蓝化后,切片直接进入醇溶性伊红Y染色液,因短时间内乙醇难以置换出组织内水分,引起染色不均匀,并且水分被频繁带入染色液会使乙醇浓度下降,伊红溶解度也随之降低并出现沉淀,染色液失效;再者伊红染色后,切片先用流水冲洗再入乙醇分化,则和组织尚未极性吸附的色酸负离子因乙醇入水的张力而脱去,结果切片染色较淡。鉴于上述原因,我们对醇溶性伊红Y的染液配制与染色方法给出以下建议: ①不用蒸馏水或纯乙醇溶解伊红,以95%乙醇为标准溶剂配制储备液和染色液。②以饱和储备液作为浓度标准。为确保储备液完全饱和,可采用恒温水浴箱或数控裱片机等水浴加热设备。禁用电炉、微波炉对乙醇直接加热,以免发生意外。③配制染色液时,切勿搅拌或振荡有沉淀的储备液,取其l份按1 ∶1或1 ∶2加入95 %乙醇,冰醋酸以1～2滴/100 ml为好。④ 切片蓝化最好采用流水冲洗,此对于盐酸乙醇分化或弱碱溶液促蓝者尤为重要。⑤切片浸染伊红前,必须先入95%乙醇处理,染色后,直接入85%乙醇分化。⑥对已经产生沉淀的染色液,尽量弃之不用。