冰冻如何做出接近石蜡的效果（花费时间再长都可以）
冰冻如何做出接近石蜡的效果（花费时间再长都可以）
各位老师好，我是一名刚接触病理技术的研究生，现遇到以下问题：
我们实验室只有冰冻切片机（机器是很老的那种，山顿牌的），没有石蜡切片机、展片机之类的，现在老板要求我们最好能利用这台机器做出石蜡切片那样的效果，我们就试着做了如下几个实验：
1、新鲜皮肤、肝脏组织各一块，5-6微米切片，酒精固定，60℃苏木精30秒-60秒，水洗，温水蓝化数秒，伊红2-5秒，酒精脱水数秒，二甲苯透明数秒，树胶封固。
结果发现片子比较模糊，没有石蜡那么透亮清晰，细胞与细胞分界不太清，细胞核也模糊，都有点“毛茸茸”的感觉，尤其是皮肤毛根部的细胞几乎融在一起了；肝脏组织里面还有大量空泡（不用二甲苯的话，空泡就没有了）；而且老板说颜色还不太对，说红的地方太红，蓝的地方太蓝；
2、为了消除那种模糊的感觉，我们就想通过“先用冰冻切片机切片，然后把片子按照石蜡的步骤走一遍”，同时按冰冻切片的步骤作对照，看效果是不是好一点，于是我们把切好的皮肤、脾脏、肌肉、肝脏各一张冰冻切片切好后置小型染色缸，丙酮中固定5分钟，70%-100%酒精脱水各5分钟，二甲苯透明30秒左右，将整个片子浸蜡约1小时，然后二甲苯脱蜡5分钟四次，100%-70%酒精逐级脱蜡至水各5分钟，蒸馏水5分钟，苏木精10分钟，水冲半小时，盐酸分化约5秒，水冲30分钟，70%、85%酒精各5分钟，伊红染色15秒，90%-100%酒精脱水各5分钟，二甲苯透明各五分钟，树胶封固。另一组则丙酮固定后，直接蒸馏水5分钟，苏木精10分钟，水冲半小时，盐酸分化约5秒，水冲30分钟，70%、85%酒精各5分钟，伊红染色15秒，90%-100%酒精脱水各5分钟，二甲苯透明各五分钟，树胶封固。
结果两者没有什么区别，都是模糊的，而且骨骼肌组织的细胞核好像都跑到细胞外去了；肝脏倒没有什么空泡，但整个结构不太清楚；脾脏大体结构是清楚的（白髓、红髓、小梁、脾小体等都能识别），但有点乱糟糟的感觉；两者的区别好像在于对照组更容易掉片（问了一位有经验的、专门做科研病理的技术老师，他说如果急着染色的话，切完片子之后就放到37℃恒温箱5分钟，如果不急着染色话，可以放在常温下，待玻片上的水珠都没有的时候再放37℃恒温箱5分钟，有其他事情需要处理的话，甚至还可以放在4℃冰箱过夜。但他没有说是否需要先固定）；
他还解释片子模糊的原因可能是取材组织本身没有固定的原因，所以细胞分解造成的，他建议可以取材后直接甲醛固定（就像石蜡一样），然后再冰冻切片之前用30%蔗糖脱水直到组织沉下去为止，再冰冻切片；他还建议后面最好还是“慢慢染色”，“快速染色”的效果他之前做好像都不太好。（这位老师是一名有丰富经验的技师，而且只做科研的，和临床病理都没有接触的，很多东西也是自学成才的，文化水平是初中，所以我们稍微有那么一点点怀疑，而且他也没有做过）
总的来说，这两种费时较多的染色方法比上述的“快速染色”在染色上要好一些，但透明度和清晰度还是不如石蜡切片；
3、我们老板后面还要求做免疫组化，但免疫组化老是做到一半就掉片，我们现在用的是一般的片子，先37℃晾干再固定（好像这样理论上对组织影响大，但那位老师说他的经验发现两者出来的片子差不多，有时先固定的效果还差一点），他建议我们可以先在玻片上涂多聚赖氨酸试一试；没有掉片的，最后做出来的结果也不如人意：一是阳性很少（怀疑假阴性），二是有阳性的地方好像定位也不太对（好像在细胞外）；那位老师解释说可能还是跟组织本身有关，比如冷冻不及时（我们用的标本是2天前用于实验HE的组织，做完HE后直接冻在-20℃冰箱，中间好像又一次冻融）造成细胞组织的破坏，抗原弥散到胞外，同时他说我们切片后的甲醛固定也可能造成“阴性”结果；
我想问的问题有：
1、上述操作步骤有没有严重错误，有的话请帮忙指出一下，毒舌一点都无所谓，晚辈是初学，需要批评和教育；
2、上面那位老师的建议是否可取，或者有什么值得商榷、改进的地方？
3、我们现在仅仅是为科研所做，所以我们追求的是片子的质量，花多长时间都无所谓，不像临床那样需要急着出报告，所以有什么好的方法能提高片子质量的，直接说就行了，时间再长都可以接受；
4、我们做皮肤病理比较多一点，关于皮肤这一块有什么需要注意的地方？
问题有点多哈，各位老师可只回答自己感兴趣的部分也可以！先谢谢了。
