doctor_wang

诸位高手，
　　我最近在作小鼠的组织切片，protocol 如下：
肝脏标本：1)
１０％中性福尔马林固定三日左右
2) 流水清洗标本半小时至１小时
脱水：
　　70%酒精　２小时
　　80%酒精　１小时
　　95% ethanol I 1 hr
95% ethanol II 1hr
100% ethanol I 1hr
100% ethanol II 1hr
二甲苯xylene I 40min
　　　Xylene II 40min
石蜡　paraffin plus I 1hr
　　　paraffin plus II 1hr
　以上脱水透明浸蜡液体温度均为６０度水浴箱中进行。
包埋　embeding
切片　４４度水浴展片
　　　　４０度烤片４小时
ＨＥ染色：脱蜡至水后，
用Mayer's Hemotoxylin 染核　１０ｍｉｎ，流水洗１０ｍｉｎ返蓝。无分化过程。
　　醇性eosin 染胞浆
　　９５％，１００％ethanol, xylene透明后封片。
问题：肝细胞核周胞浆仿佛脱失一样，无法着色。类似空泡变性？让人无法理解。尝试过更长时间的脱水透明等，均无明显改善？
　　问题出在：切片前的脱水透明出了问题？ＨＥ染色有问题？
十分苦恼！已经一个多月了，尝试过很多方案均无明显改善。恳请各位高人献计献策！祝各位新年如意！

doctor_wang

继续传低倍镜

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there are both the normal slices  in the 1st and 2nd floor.  all the slices present so strange shapes no matter control or experiment group.

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再次感谢您的指点。您是怀疑固定环节出现了问题。
我的固定是超出1:4比例的固定。因为常常仅能获得小鼠肝脏的一半甚或四分之一，所以每个样品均是固定于２０ｍｌ１０％中性福尔马林液中的小杯中的。
组织是一旦获得，立即投放于固定液中的，但是作石蜡块时常延后至半月以后，大多是在固定半月以上才来作石蜡切片的。但是新鲜的标本也不行。不知道为何？？胃肠要好些，组织胞浆脱失失色的现象少见。我作了７个批次，每次近乎１５个蜡块，仅有一个批次的蜡块效果较好。不知道是什么原因？？为此多次延长固定脱水时间均　不见效。唯一作的不大到位的是烤片。我的烤片时间大多十分不规律，多数３７度１～４小时，也试过６０烤片，发现片子上的石蜡几乎完全融化，不知道是否对组织着色以及后续的免疫组化有影响。肯定大家再次指点。

doctor_wang

您觉得还有那些环节出问题呢？
这中细胞核周边的脱色是否是一种特殊类型的脱片呢？是否与ＨＥ染色过程相关呢？？出问题的环节在那一步呢？

doctor_wang

我的所有石蜡块，均是在－２０度冰箱冻存数小时至１２小时的。

doctor_wang

I  always used the adhensive slides, superPlus ,  for preventing tissue drop off the slides. and all the processing is under temperture excluding the paraffing and embeding in the 60 centigrade.
and I wonder if the key factor is in the H&E staining process? Fixation? drying the slice?
I am eager for your advice!

doctor_wang

对不起，实验室的电脑没有中文操作系统。我试过室温下进行脱水处理，也试过各种烤片方法。目前看来可能问题出在固定上，因为我们都是使用一个１５ｍｌ的Ｓｉｇｍａ公司的中性福尔马林溶液的小杯子。并没有应用大容器。然后就是将修剪的新鲜肝脏组织（通常是半肝）予以投入杯子，肉眼估计体积比１：７左右。一直浸泡，不换液。直到我们要开始作石蜡块了，通常是半月后。因此，有可能存在像您所说的，固定不充分，部分自溶了。但是我看临床病理科，常常很大的标本，也就装在一个比标本体积大一倍的标本袋中，也就装入等体积甚或更少的固定液在里面，一样在临床上在作ＨＥ及组化。好像病理科也没有提什么意见。所以我现在也不能很肯定是哪方面的问题。