zxx9

我最近购买了新二抗（与以前所用的同一公司）、新的DAB显色组合（以前是自己配制，然后过滤），将1月份切的组织片用同样的方法试染了一次，结果同一组织以前染色阴性的地方都变成阳性了，几乎没有阴性，背景也较高；而阴性对照则正常。请问：
这是不是就叫假阳性，主要问题出在哪个环节，该如何纠正？

zxx9

shanghaiese老师:您好!
我按您的设计进行试验，结果如下： (由于我没有这么多一样的组织片，下列切片不是来源于同一蜡块，仅1.2同一来源切片，3.4同一来源切片，5.6同一来源切片，7.8同一来源切片，9.10同一来源切片。)
第一张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，自己配制的DAB。
阴性、阳性均有
第二张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，自己配制的DAB。
阴性、阳性均有
第三张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，新的DAB。
几乎全阳性
第四张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，新的DAB。
95%以上阳性
第五张切片，PBS，原来的二抗，自己配制的DAB。
阴性
第六张切片，PBS，新的二抗，自己配制的DAB。
阴性
第七张切片，PBS，原来的二抗，新的DAB。
阴性
第八张切片，PBS，新的二抗，新的DAB。
阴性
第九张切片，PBS，PBS，自己配制的DAB。
阴性
第八张切片，PBS，PBS，新的DAB。
阴性
另外我做了一组用30倍稀释的DAB(其他都是20倍稀释)，是去年7月份切的片子，两片不是来源于同一蜡块，其他同第3、第4片，结果为阴性、阳性均有。
根据这个结果是否可以认为问题在于DAB浓度过高。

zxx9

shanghaiese老师:您好!
非常感谢您的帮助！
因为我们实验室自已没有切片机，在切片上很不方便，所以只用先前剩下的切片实验。
由于有部分掉片，两片的组织结构均不全，很难一一对比，只好把染色位置分为胞核、胞浆，把DAB显色强度分1-5级，这种情况下，
第一张切片和第二张切片的染色位置一致，染色强度基本一致（不完全一样，但在同一级，2级）。
第三张切片和第四张切片，胞核、胞浆全部显色，所以染色位置一致；染色强度不一致，第三张切片约为5级，第四张切片约为4级。
老师，如果二抗和DAB试剂均没问题，只是DAB浓度的问题，那为什么第四张切片有那么强的非特异性反应，而同第四张切片一样试剂的阴性对照一点非特异性反应都没有。（这次实验所用切片之前均有染过，都正常，阴性、阳性均有）
再次谢谢您，也希望再次得到您的帮助。

zxx9

shanghaiese老师，谢谢您！
我用的是皮肤组织，蜡块组织的质量不大好。
我的二抗是“ready to use"的，可能不同批次的差异。
依您看，如果在DAB的浓度上进行试验，是否会让问题更明确。
选6张同一蜡块的切片，
第一张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：20）。
第二张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：40）。
第三张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：80）。
第四张切片，用原来的一抗，新的二抗，新的DAB（1：160）。
第五张切片，用原来的一抗，原来的二抗，自己配制的DAB。
第六张切片，用原来的一抗，新的二抗，自己配制的DAB。
第七张切片，PBS，新的二抗，新的DAB（1：20）。
您看是否有这个必要，或者其他建议。