shanghainese

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原帖由 永远 于 2010-7-28 10:00 发表
各位老师，我做免疫组化有一年多了，但是总觉得效果不是很好，比如说淋巴结，总是黄成一片，看很多老师做的片子都是包膜清晰，可我做的总觉得浑得要死，我怀疑和修复过程有关，但是不知道该怎么办才好，希望高手指点 ...

您这个问题是个大问题。是个范围很大的问题。
我认为要做好免疫组，首先组织切片要好。简单地说就是抗原保存得好，抗原的位置没有改变，抗原上的表位没有改变。
第二，抗体要好。这里说的是好抗体要有高特异性，高效价，高纯度。抗体的保存要好。没有过期， 没有变性。
第三，streptavidin-HRP 和底物要好，显色快，颜色强。
第四，要有好的protocol. 各项试剂都用在最佳浓度和使用量，孵育都在最佳时间里。

祝您好运！

shanghainese

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原帖由 永远 于 2010-7-29 11:31 发表
谢谢shanghainese老师，免疫组化的每一步都很重要，都很关键，关于抗体保存的问题，怎么知道抗体是否变性？有时候加抗体时，不小心碰到组织，抗体是不是会受到污染？还有就是我们用的是即用型抗体，对于这种应该怎么 ...

关于抗体保存与抗体的浓度很有关系.一般不少于50ug/ml。 有时加些carray protein 来增加浓度。防腐剂可用叠氮钠或proclin。抗体在-80度C 保存时间很久，但是一般不要反复融冻超过三次。
加抗体时，不小心碰到组织，抗体不一定受到污染。
即用型抗体的浓度很低。时间长了，温度过高都会影响抗体的使用寿命。

shanghainese

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原帖由 永远 于 2010-7-29 11:43 发表
曾经有老师说我做的片子阳性信号很弱，甚至有假阴性，我加了对照片，并延长了一抗的孵育时间，由原来的37°一个小时增加到了37°一个半小时，阳性信号增强，但是对照片在我看来仍旧没有达到标准，我总怀疑是我修复过 ...

孵育建议在室温，也就是20 到25度。时间不要超过两小时。或者在4度C过夜。 孵育时间过长温度过高都会产生非特异染色。
每一个抗体，每一个克隆，都有自己的特点。它们与抗原反应的表位（epitope)都可能不一样。所要求的抗原修复条件也不相同。这就要求我们仔细看说明书，严格按说明书上的步骤去做。