shanghainese

如果您愿意的话，请您做下面的实验并把结果告诉我。
第一张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，自己配制的DAB。
第二张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，自己配制的DAB。
第三张切片，用原来的一抗(一月份用的)，原来的二抗，新的DAB。
第四张切片，用原来的一抗(一月份用的)，新的二抗，新的DAB。
第五张切片，PBS，原来的二抗，自己配制的DAB。
第六张切片，PBS，新的二抗，自己配制的DAB。
第七张切片，PBS，原来的二抗，新的DAB。
第八张切片，PBS，新的二抗，新的DAB。
第九张切片，PBS，PBS，自己配制的DAB。
第八张切片，PBS，PBS，新的DAB。

shanghainese

怪我没说清楚，没让您彻底明白，请您原谅。我的本意是这所有的片子都应该是同一蜡块的，这样才能比较。
请您用显微镜看一看，第一张切片和第二张切片，第三张切片和第四张切片，它们的染色是否一致。它们的染色强度是否一致。如果一致那么您的二抗和DAB就没问题。
背景高和您的一抗，二抗浓度过高有关，与您的抗体孵育时间过长温度过高有关，如果您的DAB显色超过5分钟也会产生高背景。

shanghainese

我没有看过您的切片，也不知道您的蜡块组织的质量任何？难判断。但我感觉你的第一，第二张切片与第三，第四张切片的质量相差很大。因为“第三张切片和第四张切片，胞核、胞浆全部显色，所以染色位置一致”而第一，第二张切片没有这样的现象。我认为这才是造成您背景高的主要原因。
“染色强度不一致，第三张切片约为5级，第四张切片约为4级。”是因为它们的二抗有些差异。
您新的二抗问题不大，但我不知您用的浓度是否很好。这一点你可以查查说明书等等。
看来您新的DAB没有您自己配制的好。
您问为什么第四张切片有那么强的非特异性反应，而同第四张切片一样试剂的阴性对照一点非特异性反应都没有？
因为DBA的反应需要HRP(辣根过氧化酶)的作用。而阴性对照是没有HRP(被洗掉了或没加)，所以看不出DAB的好坏。

shanghainese

您可以也有必要调整试剂包括一抗，二抗，Streptavidin-HRP, DAB的浓度，找到最佳浓度。
但是如果蜡块质量不好，您是无法做出好的结果来的，这不是背景高和试剂不好的问题。