[求助]关于原位杂交
2．原位杂交
2. 1 载玻片处理
先用洗衣粉浸泡过夜，次日流水冲洗后泡酸液数小时。取出后用流水冲洗，再用双蒸水冲洗2-3次，置160℃以上烤箱中烘烤6h（或经15磅高压灭菌20min）。经以上处理可以清除载片上的核酸酶。
2. 2 组织切片
(1)取材：取患病牙鲆的胃、肌肉、肝脏、性腺和肿瘤。其中的肌肉，为重症牙鲆肿瘤基部的肌肉组织和其他部位的肌肉两种。由于囊肿下的肌肉易与表皮剥离，呈现黄色。同时取健康牙鲆的肌肉做对照。组织厚度1.3-0.5cm。
(2)固定：用Davison液固定组织，24h后弃掉固定液，再浸泡于70%乙醇中。
(3)脱水、透明、浸蜡。
(4)包埋：用52-54℃石蜡包埋，包埋时注意放平，否则切片不易切完整。
(5)切片。
(6)展片与烤片：用毛笔将切片转移到48℃温水中。完全展平后，使之平铺于包被了多聚赖氨酸的玻片上，置于48℃热台上，过夜。
2. 3 原位杂交，参照Wongteerasupaga(1996)、Poh-Shing(1996、1998)、Lo(1997)和Peng Shao-En等(1998)的方法进行。具体步骤如下：
(1)组织切片依次通过二甲苯（三次，5min/次）、纯酒精（2次，1min/次）、95%酒精（2次，1min/次）、85%酒精（2次，约1min/次）和50%酒精（约1min），并用蒸馏水冲洗6次（勿使切片干燥）。
(2)组织切片平放在湿盒中，向每张组织切片上滴加500μl蛋白酶K溶液（0.001g/10ml），37℃，温浴15min。
(3)将组织切片上的蛋白酶K吸干，然后放入0.4%冷甲醛液中浸泡5min。
(4)室温下，用2×SSC液浸洗组织切片5min。
(5)组织切片平放在湿盒中，每张切片上滴加500μl预杂交缓冲液，42℃，温浴30min。
(6)配制探针杂交液：按照1ml预杂交缓冲液中100ng探针的比例，计算出所需的探针量，将其煮沸10min，后置于冰水中猝冷。2min后溶于预杂交缓冲液。
(7)向每张组织切片上滴加500μl探针杂交液，置于90-95℃热台上6-10min，使组织DNA变性。
(8)把组织切片放在冰水中猝冷2分钟以上。
(9)在湿盒中40-42℃下温浴过夜（16-18hr）。
(10)依次用缓冲液2×SSC（15min，室温），1×SSC（5min，室温），0.5×SSC（5min/次，2次，42℃），BufferⅠ（5min，室温）洗涤组织切片。
(11)用BufferⅡ封闭组织切片（500μl/片），37℃温浴30 min。
(12)用BufferⅡ稀释碱性磷酸酶标记的DIG抗体（anti-DIG-AP抗体），稀释度应为1：1000（1μl/ml），将组织切片平放在湿盒中，吸稀释的Anti-DIG-AP抗体于组织切片上，37℃温浴30 min。
(13)用缓冲液BufferⅠ（2次，10min/次，室温）和Buffer Ⅲ（5min/次，室温）洗玻片。
(14)将NBT（4.5μl/ml）和X-phosphate（3.5μl/ml）加到显影缓冲液中，向组织切片上上加500μl/片该显色液，室温下黑暗中温浴1-3小时。
(15)室温下将组织切片置于Buffer Ⅳ中15 min，终止反应。
(16)组织切片依次通过蒸馏水(1min)、0.5% Bismark Brown Y (1min)、95%酒精(3次，1min/次)、纯酒精(3次，1min/次)、二甲苯(4次，1min/次)。
(17)封片。
(18)判定标准：杂交阳性细胞应呈现颜色变化，即出现蓝黑色或黑色沉淀。
2．4 HE染色：本实验对部分组织进行了HE染色、以示对照。染色方法按Bell等（1988）方法进行。
附录三：原位杂交试剂配方
10×Tris NaCl EDTA（TNE）
三羟甲基氨基甲烷（Tris Base） 60.57g
氯化钠（NaCl） 5.84g
乙二胺四乙酸（EDTA） 3.72g
双蒸水 900ml
用5M HCl调pH至7.4，定容至1000ml，高压灭菌，4℃保存
蛋白酶K（Proteinase K）原液（10mg/ml）
蛋白酶K（Proteinase K） 100mg
双蒸水 10ml
分装于无菌离心管中（0.25ml/管），-20℃下保存；用前稀释，工作浓度为 100μg/ml
0.4%甲醛（Formaldehyde）
37%甲醛（Formaldehyde） 5.4ml
双蒸水 500ml
4℃保存,倒掉前可重复使用5次.
杂交缓冲溶液(Hybridization Buffer)(终体积50ml)
20×SSC 10ml
100%甲酰胺(Formamide) 25ml
20×Denhardt’s 2.5ml
10mg/ml鲑鱼精DNA溶液 2.5ml
25%硫酸葡聚糖(Dextran sulfate) 10ml
4℃贮存.
20×Denhardt’s
牛血清白蛋白(组份5) 0.4g
菲可400(Ficoll 400) 0.4g
聚乙烯吡咯烷酮360(PVP 360) 0.4g
双蒸水 100ml
0.45m的滤器过滤,4℃贮存
25%硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)
硫酸葡聚糖(Dextran sulfate) 25g
双蒸水定容至 100ml
低热搅拌片刻,使之溶解,-20℃保存
鲑鱼精DNA(salnon sperm DNA),10mg/ml
鲑鱼精DNA(salnon sperm DNA) 250mg
双蒸水 25ml
将DNA慢慢加入水中,加热并用玻璃棒搅拌,直至完全溶解。高压灭菌。分装无菌小试管中，-20℃保存
10% 聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol)
PVA(30000-70000 MW) 10g
双蒸水 100ml
搅拌使之溶解,如有必要需加热。分装于小试管，10ml/管。-20℃保存
10×缓冲液IV
Tris Base 12.1g
EDTA•2H2O 3.7g
加双蒸水定容至 1000ml
用HCl调pH至8.0，高压灭菌。4℃贮存
显影缓冲液（Development Solution）
缓冲溶液III（Buffer III） 90ml
PVA 10ml
Levamisole 24mg
4℃保存
用前在每1ml以上混合液中加入4.5lNBT和3.5lBCIP
0.5%俾斯麦棕-Y（Bismark Brown Y）
俾斯麦棕-Y（Bismark Brown Y） 2.5g
双蒸水 500ml
把染料溶于水中。用Whatman #1滤器过滤。室温保存
