lvdou2000

本研究在于建立一种同时检测石蜡样本中UGT1A1*28(-53TA6＞TA7)和UGT1A1*6(211G＞A)位点多态性的方法。

引物及Taqman探针设计：基于Cosmic数据公布的人类UGT1A1基因的UGT1A1*28(-53TA6＞TA7)和UGT1A1*6(211G＞A)多态性位点在内的上下游序列，设计特异性扩增包括上下游引物及不同的探针信号。对于引物及探针设计，采用Primer Express 3.0.1进行设计及二聚体、茎环错配分析，在UGT1A1*28(-53TA6＞TA7)和UGT1A1*6(211G＞A)多态性位点设计特异性Taqman MGB探针，两端设计引物。所有引物及探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成。在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点包含情况，选取了扩增效果最佳的引物以及探针。

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基因

名称        序列（5’→3’）                                      产物
UGT1A1*6   上游        TCTTTCACATCCTCCCTTTGG             91bp
                     下游        TAGCACCTGACGCCTCGTT
                    G探针      FAM-AATGCTCCGTCTCTGA-MGB
                    A探针        VIM-ATGCTCTGTCTCTGAT-MGB
UGT1A1*28   上游       CCTGCTACCTTTGTGGACTGAC      132bp     
                      下游         CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT
                   TA7探针   FAM-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
                  TA6探针   VIC-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
根据其样本DNA的浓度进行稀释至10μM，采用宝日医(TaKaRa)生物技术公司(货号：RR390A)中PCRMIX及ROX作为基本原料，来配制UGT1A1*28和UGT1A1*6两个反应体系。
     Taqman探针法PCR反应体系
试剂                                                         使用量            
Premix Ex Tq                                                   10μl                 
引物（10 μM）                                                0.3μl               
FAM探针/VIC探针                                         0.6/0.2μl         
ROX Reference Dye II(50×)                             0.2μl            
灭菌水                                                               3.4μl               
DNA模板（10 μM）                                           5μl               

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         基因

名称        序列（5’→3’）                                  产物
UGT1A1*6   上游        TCTTTCACATCCTCCCTTTGG        91bp
                     下游        TAGCACCTGACGCCTCGTT
                    G探针      FAM-AATGCTCCGTCTCTGA-MGB
                    A探针        VIM-ATGCTCTGTCTCTGAT-MGB
UGT1A1*28   上游        CCTGCTACCTTTGTGGACTGAC      
132bp     
                       下游         CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT
                    TA7探针   FAM-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
                   TA6探针   VIC-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
根据其样本DNA的浓度进行稀释至10μM，采用宝日医(TaKaRa)生物技术公司(货号：RR390A)中PCRMIX及ROX作为基本原料，来配制UGT1A1*28和UGT1A1*6两个反应体系。
Taqman探针法PCR反应体系
试剂                                         使用量            
Premix Ex Tq                                   10μl                 
引物（10 μM）                                0.3μl               
FAM探针/VIC探针                            0.6/0.2μl         
ROX Reference Dye II(50×)              0.2μl            
灭菌水                                                3.4μl               
DNA模板（10 μM）                             5μl               

60℃ 1min，95℃预变性1min；95℃5s，62℃ 34s，共45个循环；60℃ 1min，在60℃时收集FAM和VIC荧光信号进行检测。

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结果判读前需要确定UGT1A1*28和UGT1A1*6的纯合野生型、杂合突变型及纯合突变型的阳性对照品的有效性。根据荧光PCR软件自动分析生成的结果，进行检测结果判断，具体方法如下：方法① Taqman探针法检测采用双色荧光，根据散点图对应样本的位置，对基因直接判读分型。方法②根据扩增曲线图进行基因型的判断。当等位基因为纯合子时，表现为一条扩增曲线，并根据其荧光信号类型判读具体基因型；而等位基因为杂合子时，表现为两条扩增曲线。


        Taqman探针法扩增曲线图及散点图判读标准
SNP位点    扩增曲线图       等位基因散点图      结果
UGT1A1*6    FAM单峰          G/G区域          G/G纯合野生型
          VIC单峰           A/A区域           A/A纯合突变型
       FAM/VIC双峰         G/A区域          G/A杂合突变型
UGT1A1*28   FAM单峰          7/7区域         TA7/7纯合突变型
          VIC单峰           6/6区域           TA6/6纯合野生型
        FAM/VIC双峰         6/7区域          TA6/7杂合突变型