lulu~

最近在做ATPase活性组织化学染色，用的是钴钙法染冰冻切片

材料是动物的肌肉组织

出现的比较严重的问题有：
1、出现大量空泡，应该是冻结不良产生的
可能的失误：
我采样时用锡箔纸包好组织块然后直接放入液氮，冻结好后放入-80℃冰箱。（也许应该用液氮-异戊烷冷冻后再放入-80℃冰箱，另外请问OCT包埋剂到底该什么时候用）
去切片时因为病理实验室离我的实验室还比较远于是用冰盒装着碎冰把组织带到目的地然后放入-20℃（当时用手摸感觉组织块还是硬的，以为没化，以后要用液氮运输了）
2、染色
虽然用了9.4、10.5、11.0、11.5、12.0的梯度pH来摸条件但是不知道是不是由于空泡太大，我觉得染上的部分颜色似乎都是差不多的深浅，就是说还没法分型

下边是我用的protocol，请大家帮我看看具体有哪些问题，感激不尽啊~~~

ATP酶染色
（一）试剂准备
1、碱性预孵育液：
0.1mol/L巴比妥钠4mL（最佳，比PBS更能保护ATPase活性），0.18mol/L CaCl2 4mL，蒸馏水12mL，调pH至 10.4。（pH值由预实验确定，可能会在10.5~11）
2、孵育液：0.1mol/L 巴比妥钠4mL，0.18mol/L CaCl2 2mL，蒸馏水14mL，三磷酸腺苷二钠盐（ATPase Na2）50mg（每次最多配100mL，可在4℃保存1个月）， 以0.1mol/L NaOH调节pH至9.4~9.7
3、其他：2%氯化钴，1%硫化铵，酒精，二甲苯，中性树胶。
（二）、染色（所有过程除水洗外全部使用滴染法，剂量200-500μL）
1、切片在室温下，置碱性预孵育液中15min。
2、切片放入37℃的ATP酶预孵育液中45min。
3、1%氯化钙液洗涤1次，10min，15min时再补加一次1%氯化钙液（或重复三次）。
4、切片放入2％氯化钴（或氯化钙）中，3min。
5、0.01mol的巴比妥钠液洗切片8次，每次0.5min。
6、蒸馏水快速浸置洗涤，拿出。
7、1％**硫化氨溶液洗涤1min（1mL硫化铵/100mL蒸馏水，必须新鲜）。
8、流水充分冲洗（决定切片美观程度）。
9、电吹风干燥，梯度酒精（70%,80%,95%,100%）各3分钟脱水，二甲苯：酒精=1：1（可略），纯二甲苯，纯二甲苯各15min透明，中性树胶封片，镜检。
（三）、注意事项  CaCl2浓度在孵育前后不能降低，否则产生的磷酸根离子不能被完全捕获而影响准确定位。如染色效果不好可在孵育前将切片放入1％CaCl2溶液中，37℃作用5分钟。

附：
酸性预孵育液：
醋酸巴比妥钠：醋酸钠1.94g，巴比妥钠2.94g，蒸馏水100mL。
0.1mol/L醋酸巴比妥钠5mL，0.18mol/L-1 CaCl2 10mL，蒸馏水8mL。
酸性预孵育液1: 0.1mol/L HCI调整pH至4.25。
酸性预孵育液2: 0.1mol/L HCI调整pH至4.6。
（二）、染色
1、切片在室温下，置碱性预孵育液中15min。
切片在室温下，置酸性预孵育液1中5min,用碱性预孵育液轻轻洗涤30s-1min。
切片在室温下，置酸性预孵育液2中5min,用碱性预孵育液轻轻洗涤30s-1min。
2……（同）

colin

前段时间本来也是打算做这个的，科室临床的标本太少也没有开展，自己也就是查了点资料。所以看不出您的问题在哪，不过希望有大师帮忙解决后大家一起交流交流！ 也好学习学习！

littleberry

前段时间我也做过这个染色，也出现了上述两个问题。对于空泡问题，曾经想用异戊烷试试，但是这个小剂量的不好买，而且很危险，所以放弃了，所以空泡问题还是没有解决，只能尽量使组织迅速冷冻，选用好点的片子染色。第二个问题我发现只要注意孵育液现配现用，调准PH值，I型和II型还是不难区分的，关键是IIA和IIB型仍然区分不明显啊。请大师快点现身指点一下吧。

liuyan926

9.ATPase
1)        常规ATPase反应全部在室温下进行
0.1Msod barbital 4ml       barbital acetate   5ml         barbital acetate   5ml
0.18McaCl2     4ml       0.1MHCl    10ml             0.1MHCl        10ml
蒸馏水         12ml      蒸馏水      8ml             蒸馏水          8ml
     PH9.7-11(15分)           PH4.6(5分)                PH4.2-4.3(5分)

        0.1Msod barbital 4ml   
        0.18McaCl2     2ml
        蒸馏水         14ml      
                 PH9.4-9.7   30秒—1分

0.1Msod barbital 4ml  
0.18McaCl2     2ml
蒸馏水        14ml  
ATPdisod salt   50mg
PH9.4-9.7(室温45分)
2）1%CaCl2洗3次  每次2分
3）2%Co Cl2    3分    4）水洗    5分
5）0.01M巴比妥钠洗3次，每次2分
6）4ml硫化铵(sulphon ammonium)+DW40ml   3分  现配
7）水洗    5—7分
8）PH4.3伊红 酒精脱水，二甲苯
9）PH10.5和PH4.5酒精脱水100%10分 2次 二甲苯
10）加拿大香胶封片固定
这个是我的方法你可以做做试试？如果还不清楚这是我的邮箱liuyan_852@yahoo.com，我们可以切磋一下

littleberry

谢谢楼上的，看来总算遇到比较有经验的了，有些问题我还想请教一下。PH4.2-4.3与PH4.6的预孵液相比在显示效果上有什么不同之处，因为我只用了PH4.6与PH10.5的预孵液，两种方法显示I型与II型的区别都很明显，但是IIA与IIB仍无法区分，请问您是怎么区分IIA与IIB的。还有，我做小鼠腓肠肌染色切片时肌肉中总有空泡，不知道你是怎么避免的。你给的这个邮箱无法接受邮件啊

linli

筋肉活检最大的问题就是冰晶，，，你整个冷冻是错误的！！！
。（也许应该用液氮-异戊烷冷冻后再放入-80℃冰箱，另外请问OCT包埋剂到底该什么时候用）   你前半句是正确的做法，，过程还要自己摸索，，，oct不能用，，一样有冰晶，但是我总认为OCT可以做，，要摸索，，包在OCT中那部分肯定会有冰晶毫无疑问！

不爱飞的鸟

5、0.01mol的巴比妥钠液洗切片8次，每次0.5min。
6、蒸馏水快速浸置洗涤，拿出。
这2步好像反了 。 我用的异戊烷-液氮法处理的  能有效避免冰晶产生。 区别不明显还是PH的问题