lihua328

按照 shanghainese 等的指导，我用漂片法做了脑组织的免疫组化的预试，我用4％的多聚甲醛固定后，然后用20％，30％的蔗糖脱水，之后切片。我是把切好的材料贴在玻片上然后放到冰箱冷冻备用。
我用了一抗的几个梯度来实验（200，400，800），并且用PBS做了一个阴性对照：结果对照的那个标本没有染上任何颜色，但是其他几个组织却出现整片染色，不过皮质的颜色还是略深，看上去就是出现了非特异性染色。
我预试的是caspase－8，结果核都着了色，我不知道问题出在哪里？我下一步该怎么实验来排除原因呢？非常着急，恳请大家多多指教！谢谢啦

yjd

一般脑组织做免疫组化是都会出现背景很深的现象，但注意实验操作方法是可以改观的。
1、一抗的浓度要合适，不一定是试剂公司提供的浓度，应找到适合自己实验结果的浓度，特别是多克隆抗体更应注意；
2、试剂盒的选择，最好不选SP或ABC方法的试剂盒，最好选非生物素的试剂盒，如“迈新”KIT-9901；
3、DAB显色时的浓度尽量低些，这样可以容易控制；
4、终止反应最好在显微镜下进行，只要出现背景时及时终止。
以上建议不知是否符合楼主的意愿，如有要帮助，请给我发贴。

lihua328

怎样控制DAB显色时的浓度呢？
我用的是即用型

lihua328

还有我用的是漂片法，不好控制染色时间啊

shanghainese

引用:

下面引用由lihua328在 2004/03/13 11:33pm 发表的内容：
按照 shanghainese 等的指导，我用漂片法做了脑组织的免疫组化的预试，我用4％的多聚甲醛固定后，然后用20％，30％的蔗糖脱水，之后切片。我是把切好的材料贴在玻片上然后放到冰箱冷冻备用。
我用了一抗的几个梯 ...

Caspase-8不应出现出现在细胞核里。一种可能是一抗有问题。其可能是一抗浓度过高。现介绍一篇文章，里面有Caspase-8的染色和染色过程。里面的染色图片很漂亮，我想其方法与您的方法很相似，供您参考之用。
The Journal of Neuroscience, July 15, 1999, 19(14):5932-5941
http://www.jneurosci.org/cgi/reprint/19/14/5932.pdf
漂片法的确是有些背景染色，有时很难去除。另外，如有条件多摸几个浓度找到最佳浓度和条件。
希望您能越做越好。

lihua328

非常感谢shanghainese的大力支持！
您说我的一抗浓度过高，可我也用了1：800的做啊，那是为什么呢？是不是4度过夜时间太长？？
还有我的切片上背景染色并不是很明显，只是似乎大部分细胞都被着色了，不知道为什么？今天在继续摸索~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
再次感谢大家的帮助！！！！：)

lihua328

[这个贴子最后由lihua328在 2004/03/16 06:07pm 编辑]

非常感谢shanghainese给我的文章，真是雪中送炭啊
不知道像这样的文章我平时要怎样才能搜索到啊？呵呵：）谢谢啦！！

shanghainese

引用:

下面引用由lihua328在 2004/03/16 11:52am 发表的内容：
非常感谢shanghainese的大力支持！
您说我的一抗浓度过高，可我也用了1：800的做啊，那是为什么呢？是不是4度过夜时间太长？？
还有我的切片上背景染色并不是很明显，只是似乎大部分细胞都被着色了，不知道为什　...

第一个问题，1：800不一定是适用浓度。有时多抗要稀释到1：2000或1：3000以上。最好用浓度概念，比如多少微克/毫升。因为各个抗体的浓度不同，在同样稀释度下浓度是不一样的。
第二个问题，如果似乎大部分细胞都被着色了，可能是您的一抗特异性不好。
第三个问题，有关文献可以到MEDLINE上寻找。
不用谢。能对您有所帮助，对大家有所帮助是我的愉快。

lihua328

还是要谢谢的！：）
我会再用其他浓度试试看，你说的多少微克/毫升说明书上有提供吗？？
一抗特异性不好是不是应该换呢？还是可有其他办法？

yjd

做免疫细胞化学染色抗体浓度与免疫组织化学染色的浓度要低得多，否则会比预想的结果差，建议你多做实验找到合适的浓度。