好好

用于稀释一抗的PBS中加入Triton-100，请问各位前辈Triton-100的浓度是多少？是0.4%？0.3%？国产和进口是否有区别？

好好

对不起，我打错了，是Triton X-100。
盼丁老师等前辈给予解答！

dingwei

你说的二种浓度都可以。

shanghainese

好好 :
If you are doing brain IHC staining, I recommend you using 0.1% Saponin.  It is much better than 0.2% Triton X-100 and less background.  It is not necessary adding these kind detergents with primary antibody.  You can incubate brain section with them before add primary antibody.

好好

丁老师、shanghainese 老师好：
我在做脑缺血方面的课题，现在需要做脑片的免疫组化。用冰冻切片，对于一些细节问题我一直都弄不懂。受经济条件限制，我采用下步骤，请你们帮我看看，可行吗？
             （冰冻切片）-20C 丙酮固定20 min
                  0.01 M PBS洗3次，5 min/次
                       3%H2O2甲醇，15 min
                  0.01 M PBS洗3次，5 min/次
                             5%羊血清30 min                              
                           一抗，4C 过夜
                0.01 M PBS洗3次，5 min/次
                           二抗，37C 1小时
                0.01 M PBS洗3次，5 min/次
              DAB显色（显微镜下控制显色时间）
           视情况决定是否苏木精衬染，分化，蓝化
                          脱水，透明，封片
一抗、二抗均用PBS稀释，结果有个通病，背景色太深，加入Triton X-100好象没有太大效果。该如何处理，是否稀释一抗的PBS中加入1%皂甙会消除，是否有其他办法？

dingwei

关键是用的是什么抗体，有的一抗（特别是科研用的）背景很黄，一点也没办法。

shanghainese

好 好 ：你 好！
我 不 知 你 用 的 是 什 么 抗 体 ， 什 么 克 隆，从 什 么 地 方 买的，很 难 给 你 好 的 建 议。不 过 你 可 试 下 稀 疏 一 抗 不 同 的 浓 度。
另 外 我 不 明 白 你 用 了 丙 酮 固 定，为 何 还 用 Triton X-100？不 妨 试 试 不 用 Triton X-100 。

好好

丁老师、shanghainese 老师好：
我的课题主要是做5-脂氧酶（5-LO）的表达,不知你们可知道或做过？抗体定出很长时间，可还没到货。
这期间，我做过NR1、VEGF、GFAP。NR1是自己实验室生产的，表达较多。VEGF是北京中山提供的Santa Cruz产品，在脑片上我一直做不出来，试过不少方法，不知道原因在哪儿？GFAP也是北京中山的，是多抗（便宜些），有表达，但不如别人（主要是老外）文献上的好看。是否用单抗会好些？
对于你们的帮助，深表感谢！

高山流云

背景染色深应考虑一抗的稀释度的问题,可多试几个浓度. 用了丙酮就不要用TritonX-100了,它们都有细胞膜打孔的作用.

好好

谢谢！
我一直以为丙酮是起后固定的作用，不知其有与TritonX-100同样的作用。我试一下降低一抗的浓度。