clsabc

本人的实验需要对心肌组织进行connexin43和ki67抗原的双重染色，不知如何实现二者的互不干扰？具体步骤如何？望指点一二！谢谢！

frankbj

看迈新公司手册：如需要，我也可以提供步骤。

clsabc

[这个贴子最后由clsabc在 2003/04/08 06:23pm 编辑]

本人急需，谢谢！不知是否为电子版？

frankbj

1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室
温20分钟。
3、pH7.2缓冲液洗三次。
4、胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。（或按说明书要求：放入抗原修复液内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或不处理）
6、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）
7、擦去多余血清，加第一种一抗37 ℃，30分钟。
8、pH7.2缓冲液洗三次。
9、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。
10、pH7.2缓冲液洗三次。
11、滴加ABC或S-P复合物，37 ℃，45分钟。
12、pH7.2缓冲液洗三次。
13、棕色DAB显色3～10分钟。
14、pH7.2缓冲液洗三次。
15、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）
16、擦去多余血清，加第二种一抗37 ℃，30分钟。
17、pH7.2缓冲液洗三次。
18、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。
19、pH7.2缓冲液洗三次。  
20、滴加ABC或S-P复合物，37 ℃，30分钟。
21、紫蓝色DAB显色
22、水洗
23、核固红复染，脱水，透明，封固。

frankbj

                         双重染色法
1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室温20分钟。
3、pH7.2缓冲液洗三次。
4、胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。（或按说明书要求：放入抗原修复液内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或不处理）
6、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）
7、擦去多余血清，加一抗37 ℃，30分钟。
8、pH7.2缓冲液洗三次。
9、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。
10、pH7.2缓冲液洗三次。
11、滴加ABC或S-P复合物（辣根过氧化物酶），37 ℃，45分钟。
12、pH7.2缓冲液洗三次。
13、DAB（棕色）或AEC（红色）显色3～10分钟。
14、pH7.2缓冲液洗三次。
15、双标阻断液，10分钟（可不用）
16、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）
17、擦去多余血清，加第二种一抗37 ℃，30分钟。
18、pH7.2缓冲液洗三次。
19、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。
20、pH7.2缓冲液洗三次。   
21、滴加碱性磷酸酶复合物，37 ℃，30分钟。
22、pH7.2缓冲液洗三次。
23、BCIP/NBT显色（蓝色）
24、水洗
25、甲基绿复染，脱水，透明，封固。
  如果选择辣根过氧化物酶可选择DAB（棕色）显色，在第21步用辣根过氧化物酶复合物，第23步用AEC（红色）显色，但要注意的是AEC不能长期保存。如选择另一个为碱性磷酸酶可选用BCI/NBT、AP-Red、AP-Orange，用BCI/NBT显色最好。

frankbj

以上均为引用

clsabc

收到。谢谢！

ljy

“胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟”会不会掉片子，双重染色要洗好多次阿！
如何保证第二次染色时，二抗、ABC复合物、DAB不与第一次染色时结合的一抗、二抗及ABC复合物起反应，如果照搬上面的方法，交叉反应是很严重的，我前两天才用失败证明过！

dingwei

胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟”不会掉片子，我做胶原时曾消化过14小时，18小时和24小时的。双重染色法更要每步洗干净，最好用二个不同种动物来源的抗体，如用同种动物的，背景是略有一点。

shanghainese

Cross-reaction is big problem for IHC double staining.  You have to block it, but not easy.  I did very good double staining BrdU-CD45R of paraffin section of mouse spleen.