合理应用二步法免疫组化检测系统
[这个贴子最后由dingwei在 2002/08/15 00:09am 编辑]
合理应用二步法免疫组化检测系统
二步法免疫组化染色技术，由于其背景低，操作简便，近几年被广泛应用。我们对几家公司的两步法免疫组化检测系统进行比较，确定不同检测系统对不同的抗原的表达特异性。
一、方法和结果
1、检测系统的选择
（1）、DAKO公司出品的EnVison检测系统
（2）、NICHIREI公司出品的N-Histofine检测系统
（3）、Antibody公司出品的Two-Step检测系统
(4 )、Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统
2、组织的选择
2002年我科常规肿瘤标本，包括多种上皮性肿瘤、间叶性肿瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴瘤。
3、抗体的选择
核表达：ER、PR、P53、Ki-67
膜表达：C-erbB2、CD3、LCA、CD20、CD30、CD79a、CD45RO
浆表达：CK、EMA、S-100、CGA、NSE、Syn、PS2
以上均选用单克隆抗体。
4、操作方法
组织切片常规脱蜡至水；TBS洗；用0.3%甲醇双氧水阻断内源性过氧化物酶（15分钟）；TBS洗；高压抗原修复（带帽出气后3分钟，立即冷却）；TBS洗；正常山羊血清封闭（15分钟）；滴加相应的抗体（每种抗体滴加3张相同的切片）（37℃，60分钟）；TBS洗；对每一种抗体相应滴加3家公司的检测系统37℃，60分钟）；TBS洗；DAB显色；苏木素复染；脱水透明封固。
5、结果（见附表1）
附表1
抗体名称 工作浓度 DAKO NICHIREI Zymed Antibody
ER 1:150 ++ + ~ ++ +++ +++
PR 1:150 ++ + ~ ++ +++ +++
P53 1:100 ++ + ~ ++ +++ +++
PS2 1:300 +++ ++ ++ ++
C-erbB2 1:150 +++ + ++ ++
LCA 1:150 +++ + ~ ++ ++ ++
CD20 1:150 +++ + ++ ++
CD45RO 1:150 +++ + ~ ++ ++ ++
CD3 1:60 +++ + + ~ ++ + ~ ++
CD30 1:50 ++ + +~ ++ +~ ++
CD79a 1:80 +++ + ~ ++ ++ ++
CK 1:150 +++ ++ ~ +++ +++ +++
EMA 1:150 +++ ++ +++ +++
S-100 1:800 +++ +++ +++ +++
CGA 1:1500 +++ +++ +++ +++
NSE 1:150 +++ ++ ++ ++
Syn 1:60 +++ + ~ ++ ++ ++
根据以上结果，我们发现DAKO公司出品的EnVison检测系统对膜抗原的表达性最强，但核表达差一点；而Antibody公司出品的Two-Step检测系统和Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统非常相似，对核抗原的表达性很强，对膜表达的抗原相对较弱。为了让核抗原和膜抗原能同时得到充分的表达，我们将EnVison与Two-Step按一定比例混合，对染色结果进行比较，发现用DAKO公司出品的EnVison检测系统与Antibody公司出品的Two-Step检测系统或Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统按7：3或8：2的比例混合，能得到核、膜、浆均满意的结果。
二、讨论
二步法检测系统由于各生产厂家采用的载体不同，导致了其检测系统对各种抗体的敏感度不同。DAKO公司出品的EnVison检测系统是用高分子的葡萄糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP（辣根过氧化物酶）结合成多聚体。由于分子量较大，可以结合更多的二抗和过氧化物酶，所有具有很强的信号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感；而Antibody公司出品的Two-Step检测系统和Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统是在一条氨基酸骨架上将多个辣根过氧化物酶和抗体的Fab段结合成多聚体，对一抗有很大的亲和性。由于二公司在产品开发时将着重点放在核抗原的表达上，所以对一抗为核表达的抗体尤为敏感。而NICHIREI公司出品的N-Histofine检测系统,从设计原理上与Zymed相似，按理说也应比较敏感，但在实际工作中，效果并不十分理想，具体原因有待于进一步探讨。
我们在日常工作中，为了使抗原得到最佳的表达，应该有选择的应用检测系统。实验证明，DAKO公司出品的EnVison检测系统与Antibody公司出品的Two-Step检测系统或Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统按7：3或8：2的比例混合，能得到核、膜、浆均满意的结果，即减少了操作步骤，又增强了抗体的特异性，可提高抗体的稀释比，节约了成本，降低了背景，具有较高的实用价值和经济价值，是各级医院和科研单位值得推荐的方法。
