临床生物样本库的建立、管理与质量控制
临床生物样本库的主要职责是收集、储存、管理和利用人类组织样本，同时配置相关信息管理数据库，给基础研究者提供进行疾病发病原因、发生发展机制研究的材料，或为临床医生进行肿瘤分期、药物筛选、靶向治疗、疗效评估、预后随访等研究提供相应的支持[1-2]。生物样本库作为医学研究的重要资源，在基础研究和临床研究间架起了一座桥梁，是转化医学发展的基石。高质量的生物样本库对探索新的治疗途径，开拓新的诊治手段，优化医药研发的资源配置等具有极其重要的价值[3]。本研究就临床常见生物样本库的建立、实施与信息化管理进行归纳总结。
1 材料与方法
1.1主要试剂及器材 医用橡胶手套、病理取材台、病理取材刀、一次性无菌刀片、镊子、1.8ml冻存管、标签、RNALater液体、液氮罐、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、红细胞裂解液、淋巴细胞分离液、超纯水、低温离心机、生物安全柜、超纯水仪、电子天平、托盘天平、试管架、一次性口罩、100～1000 μl移液枪、10 mL移液枪、1 ml灭菌枪头、15 ml灭菌离心管、1.5 ml离心管（黄色、绿色、白色）、1.5 ml离心管架、一次性无菌3 ml吸管、耐液氮条形码、黑色Mark笔、冻存盒（黄色、红色、蓝色）、冻存架、废液缸、配平用离心管、消毒片、医疗废弃袋、洗瓶、专用样本库管理系统、专用样本库温度控制系统、专用样本质量控制试剂盒等。
1.2 方法
1.2.1 样本的采集、标记、储存与信息管理 术前完善各种相关手续，由临床医师对病人家属或病人进行知情说明，签署标本留取协议书和知情同意书，并填写《病理活检申请单》、《组织入库申请单》以及《外周血样本入库登记表》。患者入院第二天，由病房护士采集外周血，每例2管（9 ml抗凝管，7 ml促凝管）。肿瘤标本手术切除后，不做术中冰冻的样本，由样本库经过培训的专门人员直接在手术室按照规范化流程取材。需要做术中冷冻的样本，由卫勤中心的专门人员将标本立即送至病理科，在保证病理诊断且肿瘤组织的体积≥2 cm的前提下，由病理科指定人员在20 min内，按照取材规范切取相应肿瘤组织、正常组织(癌/瘤旁组织3～5 cm以外或最远处)和癌/瘤旁组织(癌/瘤组织旁1 cm)。存入冻存管的取0.5 cm×0.5 cm×1 cm，各取3块；存入RNAlater 液体的取0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm，各取3块；分别装入已编号灭菌的冻存管和已放有5倍体积RNAlater 液体的冻存管中，旋紧盖子。前者先放在液氮中速冻，后移至-80℃深低温冰箱中；后者先放在有干冰/冰袋的带有盖子的泡沫盒中，后移至-20℃低温冰箱中。如组织的体积有限，先保证RNAlater液体组织的存放，但至少包含肿瘤组织和癌/瘤旁组织。血液样本由固定人员按时到病房收集，及时送至样本库并做好签收记录。专业人员及时按照操作规范分离血清、血浆、白细胞及其相关提取物，并分别冻存。所取标本分别装入不同型号的冻存管（旋紧盖子）和离心管（盖好安全扣），各自贴好标签。标签内容必须包括年份，流水号，脏器，取材部位/样本类型/样本细类，保存方式，分管号。冻存管和离心管分开存放于冻存盒中，按存放位置的坐标进行编号。冻存盒盖上标记由坐标所决定的编号，侧面标记该组织的归属系统。标本实行组织样本和血液样本分类、分组保存的模式，即每一病种的每一例标本的T/P/N 三种形态的样本和血清/血浆/血细胞/相关提取物等的样本，分别配组存放于同一位置。采用样本库专用管理系统录入样本的基本信息，实现样本相关信息的综合管理与查询一体化。
1.2.2 样本库的质量控制 取材部位的准确性（包括肿瘤组织和癌/瘤旁组织和正常组织分界的确定)、组织血流阻断至组织进入液氮中冻存所耗时间、血液标本离体至冻存所耗时间以及各种标本储存的时间等因素均影响样本的质量和研究结果[4]。为满足研究的需要，应尽量保证标本的质量和完整性，避免基因组DNA、RNA和蛋白的降解[4]。样本库指定工作人员定期、随机抽取样本，按照相关试剂盒说明书，采用RT-PCR技术及凝胶电泳法对其DNA（浓度、纯度、完整性）、RNA（浓度、纯度、完整性）和蛋白质的质量进行检测并出具质控报告，交由样本库归档。样本库的温度控制同样至关重要，本样本库购置了上海万格公司型号为MTR-2006的温度控制管理系统。温度监控范围为-200℃～200℃；温度分辨率为0.1℃；具有多级权限设置、密码及时保护、图形化显示历史数据和即时数据音乐报警、短消息报警、E-mail报警和拔号报警的功能。该温控系统彻底解决了某些单位因场地和条件的限制，部分设备分散，置于无人值守的位置；冰箱无温度显示和报警系统，或未启用温度记录仪；部分设备内存放物品超负荷，内部温度不达标（即冰箱显示温度和每一例样本温度不一定相同）；手工记录温度采集间隔过长，记录数据存在可修改性且归档和查询历史温度记录繁琐等问题。
1.2.3 样本库的管理和样本取用 本样本库由专人负责，统一管理，信息科安排专人负责样本库软件系统的维护，以保证样本从收集、保存到利用整个过程能有条不紊地进行。预使用样本库样本的个人或团队研究者，均需遵循“伦理”和“科学”的原则，在保证用于科学研究的前提下，并向医教部（科研科）提出申请，填写样本使用申请书（要求说明申请理由、使用目的、使用样本种类和数量、研究规划、预期研究结果并附上研究课题不少于200字的摘要，如系基金课题需有批准复印件，如系研究生课题必须以导师名义申请)，由所在科室主任批准后报送医教部（科研科）和医院伦理委员会部门主管领导批准。由样本库管理人员按申请要求及批复文件，提供相应的组织资源。在此基础上获得的研究成果属于研究者所有，但必需在文章中标注所用组织样本来源于XXX医院XXX样本库（格式：“XXX samples were obtained from tissue bank of XXX Hospital. All patients had signed informed consent for donating their samples to tissue bank of XXX Hospital.”）。所有申领样本的课题，其样本使用信息、课题项目任务书和研究成果反馈，均须在样本库备案。研究者进行研究后，适当提供研究结果，及时完善相关病例的背景资料，以充分利用多项研究课题之间的关联性，有效地减少重复性研究。若使用样本后三年内无任何相关的研究结果，原则上下次不予考虑样本的再使用。
2 结果
目前，本样本库已收集各类肿瘤标本约4000例，包括：舌癌3例；甲状腺癌26例；喉癌6例；食管癌250例；胃癌800例；胰腺癌270例；肝癌122例；胆囊癌12例；肺癌306例；乳腺癌210例；结、直肠癌1500例；肾癌310例；前列腺癌62例；膀胱癌37例；宫颈、宫内膜癌30例；卵巢癌56例。本样本库多数样本配套有血液标本，并进行了定期随机抽样质控。江苏省无锡市郎珈软件有限公司协同医院信息科为此开发了样本库专用软件，建立了信息化管理系统。两年来，本临床生物样本库运转较为良好。
3 讨论
临床生物样本库不是简单地收集样本，而是通过建库赋予其特定的知识价值，以产生相应的科研价值、临床价值及人类健康价值。肿瘤组织是人类直接研究肿瘤发生、发展机制的重要资源。依靠规范化的肿瘤组织样本库和相关技术平台，获取高质量的肿瘤组织样本，是保证和提高肿瘤研究水平重要的途径和手段。所以，正确、合理化地采集、保存和利用人类常见肿瘤的组织样本和血液样本，并对其进行科学地管理和质量控制，以充分利用医院现有的肿瘤资源，为人类疾病的基础和临床研究提供原始资料，就显得至关重要。
临床生物样本库来源于医学，又服务于医学研究，需要与多个学科合作才能实现规范化的构建目标。病理学科是肿瘤组织库建立的基石。肿瘤组织库建立的基本条件之一是具有辨别库存标本起源以及生物学特性的能力，这需要专业的病理学知识[5]。样本库内的生物样本是否可被持续使用依赖于对储存样本的质量控制，该项工作主要由病理学家完成。病理学家需对提取的组织先进行病理切片观察。若其中肿瘤成分超过75％则认为质量良好，如不足65％则应从研究中剔除。低温冻存是公认的组织与器官长期保存最有效的方法之一, 其原理是通过降低细胞代谢以保护组织细胞[6]。保存RNA活性的最理想方法是使用液氮保存，当温度降至液氮温度时，细胞组织中所有的生物化学、生物物理过程均处于停止状态。对样本得以储存的病例应进行定期临床随访，以便获得疾病治疗效果、临床进展及是否生存等重要资料[6]。在多学科参与合作的基础上，应加强与国内其他生物样本库的合作，研究者应尝试通过互联网共建多个组织库联合网络平台，实现肿瘤组织库的跨学科、跨区域合作[7]。各生物样本库应定期上传数据资源并实现在线共享。随着人们对临床生物样本库认知度的不断提高，我们应该充分发挥我国的地域优势和人口众多的特点，利用我国大量的医学资源，通过多学科、多研究中心的合作和交流，建设标准化、规范化、高质量化的样本库，有效、合理地发挥资源优势，协助开展肿瘤的基础及转化研究，督促样本的使用和产出。
临床生物样本库的建立包括人类遗传资源的采集、处理、利用和保存，必然涉及伦理问题，主要包括：是否有样本捐赠者的知情同意？当参与者不知道未来研究是什么的时候，如何来确保他们的知情同意？应该获得什么样的知情同意？捐赠者享有哪些权利？是否应该向捐赠者告知源于收集的样本的研究发现？如何告知？获得的样本及相关数据如何使用及共享？研究人员对样本提供者有哪些义务？组织样本的所有权到底应该属于谁? 诸如此类问题，有的人认为应该属于研究者，研究者拥有肿瘤组织的完全受益权[8]；也有人认为，研究者应该是组织标本的管理者而不是所有者，管理者的职责应该是在遵守伦理学的基础上，保证样本安全合理的用于科学研究，而不是独自享有肿瘤组织的受益权[9]。另一些人则倡导在捐献者和研究者之间建立一种公平的利益分配关系，研究者只有尊重捐献者，捐献者才能信任研究者，彼此间应该建立真诚合作关系[10]。我们认为，根据人类生物样本库的特点以及法律和伦理普遍原则，临床生物样本的采集必须在相应医疗机构内的伦理学委员会监督下进行，以保证不违反相关法规和伦理原则，保证各方的合法权益不受侵害[11]，应正确面对临床生物样本建库中遇到的各种伦理问题，制定切合我国国情的生物样本的相关伦理准则及法规，以便高效合理地利用和保护人类资源。
临床生物样本库的工作尚存在许多需要完善的方面。目前需要注意的问题主要包括：（1）制定规范化的SOPS和知情同意书；（2）制定相关伦理问题的解决方案和法规；（3）制定院内外样本的申请及使用流程指南等。其它尚需考虑：（1）政府的投入、医院领导和相关科室的重视及支持；（2）针对儿童、老干部这一特殊群体如何合理地采集样本；（3）针对库存样本，一些已经使用完毕，另一些尚未被申请使用，进一步的储存应如何筛选病例；（4）科研结果怎样反馈至样本库以减少科研重复；（5）如何扩展样本库工作的范围、增加样本服务项目等。针对上述问题，我们应该联合各个医疗单位主体和其他各种力量，以及研究者的支持和样本库工作人员的不懈努力，鼓励合作和资源共享，正向引导多病种、信息化、自动化、高质量化的临床生物样本库健康发展。
总之，建立临床生物样本库应该遵照严格审批制度和伦理认证制度，充分利用临床学科的特色优势、生物样本的稳定来源和较好的临床诊断与病理诊断条件，配备从事该项工作的场地、相关设备、软件系统及相关信息服务系统和专职队伍，制定标准化的操作流程和技术标准，并对相关人员进行定期培训，建立宣传推广制度以推进该项目的持续运行和健康发展。最终实现临床生物样本库“信息化支撑，标准化引领，规模化扩大，产业化服务，实体库分散，备份库独立，全球化推进”的长远目标。
