小聂

老师您好，请问原位杂交4%多聚甲醛（用于前固定）用缓冲液PBS的好还是用蒸馏水配好？应该如何配制比较好？固定多长时间？ :em14:

冰雪

应该用PBS缓冲液来配制4%多聚甲醛作为固定液。
取市售DEPC1ml，加入1L待处理水（双蒸水或去离子水），经猛烈振摇后，充分溶解，于室温静止数小时，然后高压灭菌（15磅20分钟）。以除去DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。
4%多聚甲醛配方：
多聚甲醛40g、DEPC水500ml、2*PBS 500ml
配法：称取40g多聚甲醛溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器中，持续加热磁力搅拌至60-65度，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH调PH至7.0，使呈清亮状，再加入约500ml 2*PBS，充分混匀，可在检测一下PH值，过滤后定容至1000ml，室温或4度保存备用。
固定：通常组织块固定4-12小时以内，过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
提供的方法不知对你是否有帮助

小聂

对我很有帮助，谢谢！！！
不过我想问一下，PH值一定为7吗？PH值对实验有很大的影响吗？请您指导。

shanghainese

[这个贴子最后由shanghainese在 2005/06/26 04:29am 编辑]

2＊PBS我想因该是2倍浓度的PBS(2X PBS).

闲云

原位杂交没你们说的那么小心，随便整还是问题不大，只要带好手套，不要吐口水影响不大，DEPC致癌呦，小心点！