勤知

谢谢丁老师

Angela

“存在一定风险，就是怕粘住了下不来，要等冻透了才行，拿下来时有可能是不该下来的那面先下来了”
请问这个问题如何解决啊？

元始

感谢丁老师

阿容

谢谢丁老师，总结得很好，受益匪浅

王华

我是个不太喜欢上网的人，主要是要干的活很多，要学的东西也很多，所以上网都是在科室上，下班了就安心的看书，我家没装电视没装网线，科室的研究生给我起了一个绰号“文明原始人”，呵呵.....
       今日周六来科室值班就上网看看，看到丁老师关于全国冰冻切片比赛的帖子，有些小感想，就和丁老师好好聊聊啦！我的一些观点不是很成熟，丁老师别取笑哦！
   丁老师真是“火眼金睛”啊！比赛时，为了快速冷冻组织、利于切片，我的组织的确是在冷冻的过程中翻转过来压了一下。丁老师说的风险的确存在，不过只要掌握好时机也能确保无虞。我的小“伎俩”是：组织托放在冻台上预冻后先加一小层胶，待胶的下1/3变白时将组织放上（放上之前组织要用滤纸吸干游离的水分，很重要），在组织周围再补一些胶，等胶与组织的下2/3变白但表面尚透明时及时将托翻转5秒后再正转过来，翻转时不能用力压，要保持组织的自然结构。经过这样处理，组织冷得快，翻转时也不会有掉下来的危险！丁老师说我的组织很大，呈圆形可能是压出来的，其实也不算是啦！我得到的那块肝组织的确是超级大，估计是不是我最后一个操作，取材的老师额外的照顾我啦？！
    因为比赛时冰冻切片机的温度是不能随意调节的，为了切好肝组织，我的切片顺序是肝—肾—肠，在肝组织没完全冻透时就开始粗刨，待到切片时肝组织的温度还不是太低，所以切片很顺利。如果组织太冷，用手去捂，可以解决裂纹的问题但组织在一冷一热的作用下，细微的组织结构会受到很大影响！
    关于组织掉片的问题，我平时做冰冻切片时软组织从来不会出现掉片的，但在比赛时其中一片肝组织切片居然掉了4/5，还好另一张只有轻微的掉片，真是万幸啊！个人分析原因：玻片表面不够光洁。这样说话，估计玻片供应商可能会很有意见。声明：仅为个人意见哦！
冰冻切片比赛中一个很重要的问题：选手们选用的冰冻固定剂是影响切片染色质量的重要制约原因。冰冻固定液需要改良啦！我在比赛时使用的是改良型Bouin固定液（我科平时也用该固定液，比赛前我们要求大会提前配好的）。固定液直接影响切片染色的好坏，当然规范的操作也很重要，但固定液不理想，切得再好也染不出好效果的！改良型Bouin固定液（苦味酸75％酒精饱和液75ml，甲醛溶液10ml，丙酮10ml，冰醋酸5ml，醋酸钠1克混合）。
这反映出目前我们病理技术需要解决的问题：加强基础知识的再学习！什么是病理技术的基础知识？是各种有关病理技术的专业书籍吗？远远不够！是基础化学，基础有机化学，染料化学、生物化学，分子生物学，病理学、组织学、甚至包括量子物理学和哲学等等！医学版的基础化学、基础有机化学是不够用的，要好好看看理工科版本的化学教科书。我们在本科学过的化学知识基本上都还给老师啦！病理技术工作者没有坚实的理论基础如何形成发散性思维？如何有创新性灵感？如何形成精准的直觉？再学习不光是为了巩固基础理论，更重要的是要跟上科技发展的步伐，让相关学科的先进知识能与病理技术产生新的“交汇点”，加快病理技术的发展。病理技术工作者不光要善于观察眼睛看的到的事物，更重要的是要能体会眼睛看不到的东西！病理技术工作任重而道远啊！呵呵......这是我对病理技术“理论架构”的个人理解，您别取笑哦！
对丁老师发的几张照片的一些个人见解：
冰脆1：肝细胞核中间，胞浆出现空泡样间隙，估计是组织冻得太冷，切片时用手捂过切下的第一张切片。一冷一热就造成了细胞结构的改变。丁老师说的改变冷冻温度是最好的方法！但如果不能改变温度的情况下，用手捂过之后，弃去3~5张切片再贴片可以改善此类状况。
冰晶多（细胞间）：个人认为那不是冰晶，而是使用了AFA或AF固定液或其他的脱水效果强大的固定液而导致的肝细胞收缩，肝索脱水变细导致肝窦增宽。
我们对经常使用的“冰晶”一词会不会是有所误解呢？
    我还是一个刚刚上路的新手，以上只是我的一些小小见解，说的不对请丁老师多多包涵啊！

dingwei

您说得非常好，佩服，学习了   象您这样的技术员太少了。都象您一样，我们的技术员就不会被人看不起，被人歧视了。在中国，病理技术行业是很悲哀的，很少会有医生真正尊重你，大多数是嘴上说的好听，骨子里看不起。所以要靠我们自己努力阿，知识才是力量。
       冰晶的问题我去好好研究一下，有个疑问：如果全是固定液引起的收缩，不是冰晶，那为什么速冻后会减少甚至没有呢？好象有点解释不通。强固定剂会有收缩作用那是肯定的，甲醇的收缩性比丙酮小的多，所以我们选择了甲醇。我们再试一下，找找真正的原因如何？

王华

我认为要理解冰冻后组织细胞的改变，首先要理解组织在活体状态下的结构。以下是我引用的一些书上的知识：
细胞原生质除有形成分外，还有可溶相胶态成分，称为细胞基质。
生活状态下的基质有一定的弹性和黏滞性，受温度、光线、水压、离子状态等因素的影响而有一定的改变：即溶胶和凝胶的相互转变。
现代研究发现，基质并非是匀质状的，其中含有极微细的网状结构，在不同情况下的基质胶态变化或许与这种微梁结构直接相关。
在细胞基质中，多数水分子以水化物的形式结合在蛋白质或其他大分子的极性区域，部分水分子呈游离状态。
-------以上知识来源于《现代组织学》2003年版第80页，编者：成令忠
关于溶胶的稳定因素及聚沉现象在医学本科教材《基础化学》第6版75页也有相关描述。
同等质量的冰的体积是水的两倍。（物理学常识）
组织是由细胞组成的，细胞间有细胞外液，细胞内有细胞内液，胞浆中的细胞器、酶、电解质等物质其实类似于“悬浮”在细胞基质中。

基于以上知识的个人理解，下面我谈谈对于冰冻切片中的一些现象的理解，生命现象是很复杂的，我的理解或许还很肤浅，说出来和丁老师探讨一下。
组织速冻产生的“冰晶少”：原因有二：1、水分快速凝固成冰，细胞内基质几乎同时凝固膨胀，细胞基质的微梁结构破坏较少，胞浆内的细胞器等有形物质基本能保持在原位。2、因为胞浆中的大部分水是以水合物形式结合在蛋白质或其他大分子的极性区，速冻可以阻止水分子游离出来，保持基质的匀质。
组织冷冻慢，在温度缓慢下降的过程中，一是细胞基质的微梁结构和溶胶状态受到影响导致细胞器等有形物质的聚集与沉降；二是在细胞冷冻凝固之前，水分子与极性大分子间的氢键受到破坏，使以水合物形式存在的水分子游离出来，基质中的微梁结构又受到破坏，使得游离水聚集在一起，游离水聚集的地方在冰冻切片胞浆中成为空洞样结构，也就是的所谓“冰晶”。
以上的理论基础也可以解释：一、为什么捂过之后的冰冻组织切片上胞浆形成很多空洞，胞核内染色质边集等现象。二、为什么慢冻组织比速冻组织更容易形成“冰晶”。
做得好的冰冻切片应该和常规HE切片一样好看！冰冻切片还有一个常规切片没有的优势：冰冻切片的组织形态结构与活体状态更为接近，常规脱水过程中组织细胞或多或少会收缩，不同的组织收缩度不同，使组织形态结构与活体状态有所差距呢！

以上纯属个人观点哦！非常希望能得到丁老师的指导！

王华

要理解各种冰冻固定液的特点，首先得从理解各种固定液对组织的固定原理开始，我看了一些书，但还不能很系统很完整的描述，也希望丁老师研究研究，咱以后再交流这个问题。呵呵。。。。。。给丁老师“布置任务”啦！您千万别生气哦！

王华

要理解胞浆基质溶胶状态在冷冻后会有什么改变，有一个比较形象的方法：买一个果冻放到冰箱里冻结后拿出来解冻，看看会有什么改变？
当然啦，生命现象比果冻要复杂得太多啦！
其实微观世界在宏观世界里也能找到相似之处的！“窥一斑而知全豹”“一滴水也能看到整个海洋”“一叶而知秋”也！
哲学思辨过程要渗入生活、工作、甚至生命啊！

dingwei

哈哈，太好了，关于冰晶的理论你说得非常正确，我很喜欢有人提出不同意见，只有这样，才有可能把自己的错误观点纠正过来。对这我从不生气，我经常让我的学生提不同意见，做各种对照实验，这样才能进步，一个人懂得知识是有限的。对于固定液，我好久没搞了，也应该认真再研究研究。
向你好好学习，以后多多交流。