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巴氏染色中饱和碳酸锂返蓝时间如何掌握

引一段王华的分析给大家参考:
“染完苏木素分化后进行一步“返兰”,就是用碱性溶液中和掉组织中的酸性,使苏木素呈现蓝色。如果不用氨水、碳酸锂溶液返兰,用温水、流动自来水浸泡时间长一些也能去除组织中的酸性,使苏木素返兰。
    返兰之后要充分将组织中多余的碱性溶液充分洗净,因为残留的碱性溶液会影响伊红的着色。
    伊红是通过伊红分子中的羧基电离后带负电,与蛋白质中带正电的氨基端或侧链氨基(-NH4 )结合,使蛋白质染色。
    如果碱性溶液在组织中残留,蛋白质是两性化合物,在碱性环境中,蛋白质就出现羧基端电离呈负电,氨基端不带电,整个蛋白质分子呈负电。伊红是负电,蛋白质是负电,负负相斥作用,伊红就染不上了。
    在返兰后清洗的实际操作中,容易出现的现象是碱性返兰液清洗不彻底,组织局部碱残留,就呈现出同一片组织内局部红局部不红的现象了。

    尽管氨水和饱和碳酸锂都能达到返兰的目的,基于这两种物质不同的化学性质,这两种溶液在使用过程中还是有一些差异的。

    氨(NH3):  易溶于水成为氨水(NH3H2O,也称氢氧化铵),氨水具有强碱性。氨的分子结构:NH3,N原子为不等性sp3杂化,4个杂化轨道中的3个 分别与H原子形成σ键,整个分子呈三棱锥形结构,N原子的另一个sp3杂化轨道被一对孤对电子占用,位于棱锥形的顶端。

    碳酸锂(Li2CO3):强碱弱酸盐,具有碱性。1g溶于78ml冷水。

    碳酸锂在水中的溶解速度比氨水要慢,所以返兰后浸泡清洗的时间要稍长一些。无论哪种返兰液,都要保证清洗干净。个人经验:冷水浸洗3次,每次1分钟。第2第3次可以用40度左右的温水清洗,可以缩短时间,效果不错。
    N的电负性是3.05,并且氨基有一对孤对电子, 使得氨基中的N极易与蛋白质中的H形成氢键。氨基这个特性引起组织中蛋白质的二级三级构象发生改变,导致蛋白质出现“松解”的现象。组织与载玻片粘连,组织与载玻片形成氢键起到重要作用。氨可以破坏组织与载玻片的氢键,使组织与氨形成氢键。这也就解释了为什么用氨水进行返兰,组织容易掉片的原因。”

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引用:
原帖由 leexiaosun 于 2010-4-7 10:14 发表
本人有个疑惑,在巴氏染色中为了节省时间,一般都有弱碱促蓝,比如用碳酸锂溶液,促蓝的时间该如何掌握?一般资料上都写到涂片蓝为止。但蓝色的定义各人有各人的观点,有的认为浅蓝就OK,有的则认为深蓝才OK。不知各 ...
我个人认为用碳酸锂或氨水促蓝,1~3秒就可以了,返蓝后一定要充分冲洗,冲洗时间应根据自己所在地的条件而定(如:气温、水的酸碱度等),以制片后不会出现同一涂片上部分细胞(细胞质)红部分不红的现象为准。

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