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此文转载于《诊断病理学》杂志2008年6期
常规HE 染色易出现的问题、原因及解决方法
田玉旺,李　琳,朱红艳,邢　宜,苗金红　(北京军区总医院病理科, 北京　100700)

3 　切片染色模糊不清( 灰染) 的原因
3. 1 　取材　在取材时组织标本已经发生霉腐自溶,或取材后没能及时固定、固定液浓度不够,必然造成组织结构模糊
不清,这是由于组织结构分解变性、组织变酸所致,因而切片被染成灰蓝色。另外,固定前已干枯的标本,染色后易在干
枯区域内出现成片的灰染现象,很难补救。
3. 2 　固定　①固定剂对组织有一定的媒染作用,它既可与蛋白质结合,又能与染料结合,故可增强着色能力;同时固定
剂能沉淀和凝固细胞内成分,使细胞内成分产生不同的折光率,造成光学上的差异,使得原本看不清的结构变得清晰起来,所以,组织固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因。②存放标本的固定液浓度不宜过高或过低,浓度偏低,在正常固定时间内蛋白质沉淀和凝固必然不充分,使细胞内成分产生的不同折光率差异不够显著,原来看不清楚的结构也就不能清晰起来。而且由于浓度低、固定不足,其媒染效果也差,故易出现切片模糊不清现象。浓度过高,对蛋白质沉淀和凝固作用太强,使组织表面迅速变硬,减弱了固定液对组织的渗透能力,造成组织中间部分固定不佳,甚至达不
到固定目的,亦易出现切片模糊不清现象。补救方法:可换成正常的固定液重新固定。③在送检的标本中,有时临床科用乙醇固定组织,常温下,乙醇沉淀的白蛋白、球蛋白不再溶于水,而核蛋白则可再溶于水,因此,造成乙醇固定的标本,
切片核染色不良,胞质染色也较差,切片出现模糊不清现象。补救方法:用4 %中性甲醛对标本再固定。④在日常病理制
片工作中,经常发现淋巴组织(淋巴结、鼻咽部组织及扁桃体等) 由于处理不当造成切片染色后组织间出现发灰现象,其
主要原因可能是由于其细胞密集、结构复杂,导致固定液较难渗透到组织深部,从而造成组织中央固定不佳,而出现切
片发灰现象。可用等量无水乙醇乙醚混合液处理切片5～10 min ,95 %乙醇、80 %乙醇洗,水洗,3 %硫酸铁铵溶液补充
媒染5 min。
3. 3 　温度　包埋时如果温度过高或切片后烤片温度过高,均会使组织蛋白质发生质变,可能发生拒染,造成切片染色
模糊不清。
3. 4 　脱蜡　切片脱蜡不彻底造成不着色或着色很淡,镜检
时切片呈模糊不清。
3. 5 　染料　染料质量差或染液配制失当,如配制苏木精时加热使氧化过度,不能生成三氧化苏木红,生成四氧化苏木
红,使染液没有染色能力;或苏木精使用时间过久,导致切片
着色不良,切片模糊不清。
3. 6 　分化过度　胞核、胞质着色较淡,致切片模糊难辨。
3. 7 　脱水、透明不彻底　切片如在二甲苯中有白雾现象发生即表示乙醇脱水未尽,应退回乙醇重新脱水;否则,肉眼切
片呈云雾状,镜下所见组织结构则模糊不清。
3. 8 　封固　①要注意避免口、鼻呼出的气体接触组织切片上的封固剂,因呼出的气体中含有水分; ②在潮湿(阴雨天)
的环境里封片动作必须迅速,以避免空气中的水分进入封固剂内,影响切片质量。
4 　切片污染的原因
4. 1 　组织碎屑污染　在整个制片过程中,应避免将一种组织混入到另一种组织中,造成不应有的差错。
4. 2 　染液及试剂污染　染液中的色素颗粒及试剂的沉渣或污物在染色时均可致切片被污染,如常见的苏木精沉渣。苏
木精沉渣是指苏木精在氧化剂的作用下染液表面形成的一层氧化膜和在媒染剂的作用下形成的氢氧化铝结晶。新配
制的苏木精染液使用一段时间后经常有结晶析出,染色过程中附着在组织上(特别是含有黏液的组织) 影响病理诊断。
采用下面方法可避免苏木精沉渣产生: ①定期用滤纸过滤陈旧苏木精染液; ②切片脱蜡至水,入1 %碳酸氢钠水溶液处
理,而后用陈旧苏木精染液染色; ③每次染色前,用旧报纸将染液表面的氧化膜捞掉。
4. 3 　灰尘污染　组织切片在染色前及染色时,均可能被灰尘污染。
5 　染色困难的原因
染色困难是指组织切片在染色时着色淡或不易着色。其原因多为组织用酸性甲醛固定或组织在甲醛中固定时间
过久所致。甲醛暴露于日光或与空气接触久置后,甲醛自行分解产生甲酸,而使溶液呈酸性影响伊红染色,严重时可影
响细胞核着色。解决方法: ①防止甲醛自行分解,在备用甲醛中加入适量的碳酸镁或碳酸钠,或用大理石作为中和剂;
②固定时,建议用磷酸缓冲液配制的中性甲醛或弱碱性甲醛固定组织,必要时,还可采取二次固定。
如以上措施效果不佳,再采用以下补救措施: ①脱水前将组织用自来水冲洗> 12 h ; ②染色时,组织切片脱蜡后流
水冲洗> 12 h ; ③问题严重的,用1 %碳酸锂水溶液等弱碱性溶液浸泡组织数小时或过夜,再用自来水洗,以利于染色; ④
甲醛固定较久的组织切片在进行常规染色和特殊染色着色欠佳时, 切片染色前用5 %重铬酸钾水溶液处理切片
> 30 min ,水洗后再染色,可使染色效果得到一定改善; ⑤苏木精染料是一种有色的有机化合物,若无媒染剂存在时对组
织的亲和力很小,但在媒染剂的作用下具有很强的染色能力。根据此原理,对染色困难的组织切片染色前采用3 %硫
酸铁铵溶液进行补充媒染,这样可以加强组织细胞与苏木精染液的亲和力,利于细胞核的着色; ⑥延长苏木精的染色时
间,加强苏木精与细胞核的结合力。
6 　切片易褪色的原因
　　制成的组织切片,其染色结果有的能持久保存,有的则易褪色,其常见原因可归纳为两大类: ①染料的性质及染料
与组织的作用,染料与组织所形成的色淀结合牢固,其染色结果就能永久保持; ②制片过程中的原因致切片易褪色。
6. 1 　组织处理不当　①固定不佳或固定时间过久(酸化) ,固定液pH值不适宜; ②固定较久的组织,特别是用含铬酸、
重铬酸钾及锇酸等固定的组织,脱水前未将组织内部的固定液经流水彻底冲洗除去,影响了细胞核染色和保存。
6. 2 　染色前处理失当
6. 3 　染色时处理失当　染液及所用试剂酸碱度不适宜是一个很常见的重要原因。如HE 染色时,用碱性过大的溶液返
蓝,就易引起胞质褪色,而用pH 715～8 的弱碱性溶液返蓝并经自来水彻底冲洗,就不易引起切片褪色。在配制伊红染
液中,若加入促染剂冰醋酸过多,染液混浊甚至沉淀,短时间就失效不能再用,染色结果保持时间很短,染色后切片极易
褪色。因此每100 ml伊红染液加1～2 滴冰醋酸较好,如摇动有大量泡沫浮在液面较长时间不消失,说明染液内冰醋酸过
多,反之,泡沫少很快消失。
6. 4 　染色后脱水、透明失当
6. 5 　封固剂酸化　封固剂多用二甲苯作为溶剂,时间过长时其中的二甲苯逐渐氧化,生成苯甲酸和邻苯二甲酸而呈酸性,可导致苏木精褪色。故封固剂的酸碱度要适宜,尽量应用中性封固剂。我们在封固剂中放少量大理石或无水碳酸钠,置低温干燥箱内,充分搅拌待澄清后,取上清液备用较好。
6. 6 　封固时天气潮湿　多雨、湿气浸入、组织切片内混入水分含有气泡、封固剂较稀或用量少、盖片小或不平、盖片位置不适当或被移动等,不但可致切片染色模糊不清,而且切片
易褪色。
6. 7 　染色后长期光照　封固剂及切片长期置于日光或强烈灯光下,尤其是暴晒于日光下,易引起氧化变酸致切片褪色。
另外,将封固后的切片加温烤干或室温过高时,均能加速封固剂氧化,易引起切片褪色。
6. 8 　载、盖玻片处理不当　不呈中性。
7 　HE 染色组织切片中的类色素样颗粒
　　此种颗粒也称空气色素颗粒,一般散在或成片状,圆形或不规则形,易被误认为黑色素或甲醛色素沉着。其分布无
规律,可在任何组织切片中出现,但肝组织中更易出现。主要原因: ①切片染色后封固时,切片中的二甲苯已完全挥发
或切片不经过二甲苯透明,此时树胶不能完全封固切片,而形成干燥的空气气泡或腔隙; ②树胶中含有水分; ③树胶封
固剂过稀,封固当时切片内并不出现黑点,当封固剂干燥或待二甲苯挥发后切片内可出现小黑点; ④树胶浓度过高,流
动不均匀,滴加的封固剂不能完全覆盖切片; ⑤切片脱水、透明不彻底。
解决方法: ①切片染色后,经过石碳酸- 二甲苯混合液
(1∶3) 处理或纯二甲苯充分透明后再用树胶封固,可防止该色素颗粒产生; ②调整树胶浓度,可湿封固。
8 　HE 染色组织切片中似细小水珠样杂质
　　主要分布在腺体周围。许多人认为此杂质是水珠,是否为水珠,要看切片在高倍显微镜下是否清楚,若组织细胞结
构清晰,就不是脱水不净,可能是封固时切片干涸而造成的细小气泡所致。解决方法: ①脱水不净应乙醇重新脱水; ②
切片干涸应重新在二甲苯中脱胶后再封固。
9 　产生气泡的原因
①切片厚薄不均搓板样、切片不平整、胶液扩散不均所致; ②展片水温过低组织未展开或水底产生的气泡浮在组织
上,脑组织等在捞片时组织下面亦易产生气泡; ③封固胶过稀或过稠; ④封固时操作不当。盖玻片先一侧置于滴有胶液
的组织上,然后缓慢放下可解决此问题。
综上所述,HE 染色组织出现模糊不清(灰染) 的原因是多方面的,其中有的并非染色技术问题,而是由于染色前的
取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等处理不当所致。所以,制片过程的每一个环节都必须认真对待,科学处理,精心制作,才会获得质量优良的切片,否则就会影响到染色质量。而在诸多因素中,尤以固定最重要,它是组织切片染色成败的首要因素。

huage5401

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