九日

此文转载于《实用医技杂志》2009 年6 月第16 卷第6 期

人工骨成骨模型免疫组织化学染色方法的构建
作者：余杏娟  陈诗萍  温兴涛

骨折愈合是创伤愈合的一种特殊类型，是一个复杂的组织学、分子生物学、生物力学、内分泌学的动态过程。在对骨骼生理和病理的研究过程中，由于骨骼组织的特殊性，制备好的骨免疫组织化学标本不是一件容易的事。本实验以大鼠单纯胫骨骨折后加入骨粉复合物为模型，观察乙二胺四乙酸（EDTA）-2Na 脱钙和混合酸脱钙后免疫组织化学检测的效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料
重组骨形态发生蛋白（rhBMP）-2：纯度>95％，由广州达晖生物技术有限公司提供；人工骨粉：羟基磷灰石生物陶瓷，由北京意华健科贸有限公司提供。
1.2 实验方法
取rhBMP-2 冻干粉溶于无菌注射用水中，制备成100μg/mL 浓度的溶液，将溶液浸透人工骨粉，经离心充分混合、
室温自然挥发72 h、复合物干燥箱烘干后待用。动物实验中将骨粉复合物放置于300 g 左右大鼠（共20 例）左侧胫骨3mm 长的骨块缺损中（经多次称质量一般需6~7 mg）。观察骨缺损的愈合情况（见图1）。
1.3 免疫组织化学所用仪器的名称、品牌；检测的方法及程序1.3.1 所用仪器：全自动脱水机Shandon Excelsior（英国珊顿公司），包埋机Shandon Histocentre 3（英国珊顿公司），切片机MICROM HM450（德国MICROM 司），烤箱ESPES 中外合资爱斯佩克公司），全自动染片机Shandon Varistin Gemini（赛默飞世尔科技公司），自动封片机Promounter（Meisei 公司），显微镜Olympus 日本Olympus 公司。
1.3.2 脱钙方法：标本切割制成含一个种植体的小骨块，种植
体周围至少有5 mm 骨组织。将标本立即投入甲醛溶液中固定48 h，中间换液1 次。20 例标本分为两组，每组10 例。实验组：EDTA-2Na 脱钙[1， 2（] EDTA 20 g。双蒸水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，用HCl 调pH 至7.4 左右）。将骨组织放入微波炉专用盒，放入脱钙液，在微波下50 ℃左右间歇脱钙，每次脱钙循环辐射2 min，以30 个脱钙循环为****脱钙终点。在各循环之间将标本盒取出微波炉外，室温冷却，每次辐射中脱钙液温度<70 ℃。对照组：混合酸[3（] 10%甲醛生理盐水85 mL+甲酸8 mL+氯化铝4 g）脱钙1 个月，每24 h 换液1 次。脱钙后取出种植体，梯度酒精脱水，二甲苯透明30 min，60 ℃恒温下硬蜡透入3 h 后包埋。手摇切片机连续切片6张，厚度6 μm，其中4 张用于染色，2 张备用。烫片台法贴片。石蜡切片免疫组织化学染色按SP 法进行染色。
1.3.3 免疫组织化学检测方法：材料：一抗鼠抗人单克隆抗体（浓缩液）。步骤：①包埋，切片，至烤箱60～70 ℃ 30 min；②常规脱蜡至水；③蒸馏水洗2 次；④用4％双氧水8 min；⑤抗原修复（高压锅EDTA pH 8.0 处理）：EDTA pH 8.0（1 ∶50稀释），煮沸后，加入片子，盖盖后，喷气后计时2 min；⑥自然冷却；⑦加一抗（肥大细胞类胰蛋白酶）水浴箱37 ℃ 40 min；⑧倒掉一抗，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗；
；⑨ PBS pH 7.2～7.4
3 min×4；⑩加二抗（Dako Envision K5007）室温20 min；倒掉二抗，用PBS 冲洗；PBS pH 7.2～7.4 3。min×4
DAB 显色（Dako Envision K5007 显色系统））1∶50 稀释。显微镜控制显色结果。蒸馏水终止显色。蒸馏水冲洗。
复染苏木素，2 min，分化，返蓝。过95％酒精。烤箱烘干。中性树胶封片。显微镜观察结果。
结果
免疫组织化学检测显示棕黄色颗粒状物质为表达阳性。棕黄色颗料分布于间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞及骨细
胞内为强阳性反应。EDTA 脱钙组骨小梁结构保存完整，鼠抗人单克隆抗体（浓缩液）在骨细胞、成骨细胞及骨髓基质细胞胞浆中都有表达，呈黄色丝状分布（图2）。混合酸脱钙后，骨结构破坏较多，抗原破坏较严重，在骨细胞、成骨细胞及骨髓基质细胞胞质中阳性表达明显减少（图3）。

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