九日

石蜡组织块改制超薄切片的方法
材料和方法
正常小白鼠断椎立即取肝脏, 切成3mm ×3mm ×3mm 的长条状组织块, 用4% 多聚甲醛固定4h。分三组。
1. 对照组: 固定的组织, 浸入011mo löL 磷酸缓冲液(PBS, pH 7130) 中, 振荡切片机切片, 厚度为50Lm。011mo löL PBS 漂洗3 次, 时间为2h。1% 锇酸固定1h。50%、70%、90% 乙醇及90% 丙酮依次脱水, 每次5m in。100% 丙酮脱水3 次, 每次5m in。100% 丙酮与包埋剂1∶1 混合浸透30m in, 100% 丙酮与包埋剂1∶2 混合浸透1h。纯包埋剂浸透30m in。倒扣包埋, 聚合温度为37℃12h, 60℃ 24h。
2. 实验组É : 固定的组织, 常规石蜡包埋, 石蜡切片机切片, 厚度为15～ 20Lm, 把片子浸入30℃左右的温水中, 使片子展开, 并用镊子把组织周围的蜡除去。片子浸入2% 锇酸与环氧丙烷1∶1的混合液中室温存放10m in, 其间振荡几次, 进行脱蜡及锇酸固定。环氧丙烷脱水3 次, 每次5m in。环氧丙烷与包埋剂1∶1 混合浸透30m in, 环氧丙烷和包埋剂1∶2 混合浸透1h。纯包埋剂浸透30m in。倒扣包埋, 聚合温度为37℃ 12h, 60℃ 24h。
3. 实验组Ê : 固定的组织, 常规石蜡包埋, 切石蜡片与捞片同实验组É。片子浸入二甲苯30m in,进行脱蜡。乙醇30m in, 90%、70%、50% 乙醇水化, 每次10m in, 0. 1mo löL PBS 4h, 其间换液5次。1% 锇酸固定。脱水、浸透、包埋、聚合同对照组。
4. 病理组: 肿瘤组织用10% 中性福尔马林固定。常规石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水、浸透、包埋、聚合同实验组É。
以上四组标本聚合后, 定位、超薄切片、铀铅染色,H2800 透射电镜观察。
结果与讨论
采用上述几种方法制备的标本, 在电镜下, 正常对照组中的细胞结构清晰, 细胞核以常染色质为主, 可见核仁, 胞浆内含内质网、线粒体等细胞器(图1)。实验组É、Ê、病理组的细胞结构不如对照组中的清晰, 但大部分细胞的轮廓清楚, 膜结构存在, 细胞核中的染色质及胞浆中的细胞器保存尚好(图2、3、4)。
石蜡块改制电镜样品, 多数实验室是采用二甲苯脱蜡, 这种方法时间长, 步骤繁琐, 我们通过反复实验, 脱腊改用环氧丙烷和锇酸混合液的方法后, 省略了脱蜡后的水化和后固定等步骤, 直接进入浸透、包埋, 缩短了电镜制样过程。对于石蜡块改制电镜样品的处理, 主要的问题是如何保第3 期陆月良等: 石蜡组织块改制超薄切片的方法38　7　护微细结构, 尽量避免再次出现内容物的丢失及抽提, 所以标本再处理的步骤及时间应该越少越
好。我们对几组实验的对比观察结果来看, 组织的细胞结构与最初标本所采用的固定液、固定方式和新鲜程度有直接关系。例如病理组, 标本是经10% 中性福尔马林固定, 而且标本放置时间较长, 细胞结构的清晰程度不如实验组É、Ê。但从细胞超微结构形态的保存情况来看, 均能用于电镜诊断。因而建议在病理标本初固定时, 应用较严格的固定程序。如调整pH 值后的中性福尔马林固定等, 将会获得更好的效果。
在制样过程中, 我们体会到脱蜡很关键, 如果脱蜡不尽, 树脂难以完全浸透, 要影响包埋后的超薄切片, 即便能切下片子, 在电镜下也会出现大小不等的空洞, 难以观察。因此, 石蜡组织块改制电镜样品, 应把握好脱蜡这一步。
根据我们常规使用, 虽然实验组É 与实验组Ê 结果相似, 但在操作过程中实验组É 的方法更简便、快速, 值得推广应用。
此文转载于《电　子　显　微　学　报》1999 年6 月
作者：陆月良　颜永碧(第二军医大学中心实验室, 上海200433)