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为何我的小鼠肝脏HE染色如此奇怪?——胞核周围胞浆仿佛完全脱失?急救!

为何我的小鼠肝脏HE染色如此奇怪?——胞核周围胞浆仿佛完全脱失?急救!

诸位高手,
  我最近在作小鼠的组织切片,protocol 如下:
肝脏标本:1)
10%中性福尔马林固定三日左右
2) 流水清洗标本半小时至1小时
脱水:
  70%酒精 2小时
  80%酒精 1小时
  95% ethanol I 1 hr
95% ethanol II 1hr
100% ethanol I 1hr
100% ethanol II 1hr
二甲苯xylene I 40min
   Xylene II 40min
石蜡 paraffin plus I 1hr
   paraffin plus II 1hr
 以上脱水透明浸蜡液体温度均为60度水浴箱中进行。
包埋 embeding
切片 44度水浴展片
    40度烤片4小时
HE染色:脱蜡至水后,
用Mayer's Hemotoxylin 染核 10min,流水洗10min返蓝。无分化过程。
  醇性eosin 染胞浆
  95%,100%ethanol, xylene透明后封片。
问题:肝细胞核周胞浆仿佛脱失一样,无法着色。类似空泡变性?让人无法理解。尝试过更长时间的脱水透明等,均无明显改善?
  问题出在:切片前的脱水透明出了问题?HE染色有问题?
十分苦恼!已经一个多月了,尝试过很多方案均无明显改善。恳请各位高人献计献策!祝各位新年如意!
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继续传低倍镜

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会不会是脱片的一种特殊形式?问题出在烤片?

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there are both the normal slices in the 1st and 2nd floor.

there are both the normal slices  in the 1st and 2nd floor.  all the slices present so strange shapes no matter control or experiment group.

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40度烤片, sometime 30min , sometime 4hr.

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再次感谢您的指点。您是怀疑固定环节出现了问题。
我的固定是超出1:4比例的固定。因为常常仅能获得小鼠肝脏的一半甚或四分之一,所以每个样品均是固定于20ml10%中性福尔马林液中的小杯中的。
组织是一旦获得,立即投放于固定液中的,但是作石蜡块时常延后至半月以后,大多是在固定半月以上才来作石蜡切片的。但是新鲜的标本也不行。不知道为何??胃肠要好些,组织胞浆脱失失色的现象少见。我作了7个批次,每次近乎15个蜡块,仅有一个批次的蜡块效果较好。不知道是什么原因??为此多次延长固定脱水时间均 不见效。唯一作的不大到位的是烤片。我的烤片时间大多十分不规律,多数37度1~4小时,也试过60烤片,发现片子上的石蜡几乎完全融化,不知道是否对组织着色以及后续的免疫组化有影响。肯定大家再次指点。

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您觉得还有那些环节出问题呢?
这中细胞核周边的脱色是否是一种特殊类型的脱片呢?是否与HE染色过程相关呢??出问题的环节在那一步呢?

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我的所有石蜡块,均是在-20度冰箱冻存数小时至12小时的。

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I  always used the adhensive slides, superPlus ,  for preventing tissue drop off the slides. and all the processing is under temperture excluding the paraffing and embeding in the 60 centigrade.
and I wonder if the key factor is in the H&E staining process? Fixation? drying the slice?
I am eager for your advice!

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对不起,实验室的电脑没有中文操作系统。我试过室温下进行脱水处理,也试过各种烤片方法。目前看来可能问题出在固定上,因为我们都是使用一个15ml的Sigma公司的中性福尔马林溶液的小杯子。并没有应用大容器。然后就是将修剪的新鲜肝脏组织(通常是半肝)予以投入杯子,肉眼估计体积比1:7左右。一直浸泡,不换液。直到我们要开始作石蜡块了,通常是半月后。因此,有可能存在像您所说的,固定不充分,部分自溶了。但是我看临床病理科,常常很大的标本,也就装在一个比标本体积大一倍的标本袋中,也就装入等体积甚或更少的固定液在里面,一样在临床上在作HE及组化。好像病理科也没有提什么意见。所以我现在也不能很肯定是哪方面的问题。

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